Gu цоколь: Основные виды цоколей ламп — groupnk.ru — Группа НК — комплексные поставки электрооборудования в Москве и регионах

Содержание

Какие лампочки выбирать? Зависит от цоколя!

Цоколь — элемент, необходимый для крепления лампы в патроне и подведения к ней электрического тока. Ответная часть для цоколя лампы называется патроном. Чтобы закрепить лампочку в патроне необходимо, чтобы цоколь лампы и патрона были одного типа. Цоколь, как правило, изготовлен из метала, но иногда бывает из пластика, керамики/частями из керамики, или даже из стекла.

Цоколь лампы и патрон должны обеспечивать изоляцию проводников друг от друга, механическую прочность соединения, выдерживать температуру при работающей лампе. Патроны, изготовленные из керамики (обычно электротехнический фарфор), выдерживают гораздо большую температуру, чем карболитовые или изготовленные из других видов пластика. Электрические контакты в патроне должны выдерживать рабочие токи и обеспечивать надежный электрический контакт с цоколем лампы. В случае, если важно точное положение лампы (например, в кинопроекторе или в фокусе рефлектора), то патрон имеет конструктивные элементы, обеспечивающие точность позиционирования.

Выводы лампы накаливания часто припаиваются к цоколю мягкими припоями, поэтому температура патрона и цоколя во время работы лампы не должна превышать температуру плавления припоя (то есть быть ниже 180 °C). Также необходимо учитывать тепловое расширение узлов во всем диапазоне температур, поэтому часто патроны имеют предусмотренные упругие элементы, в том числе пружинные контакты.

Наиболее распространенные неисправности соединения цоколь-патрон вызываются перегревом патрона, потерей пружинных свойств контактами, окислением контактов. Иногда цоколь в патроне

«закисает» и попытка заменить такую лампу заканчивается тем, что цоколь отрывается от баллона лампы и остается в патроне. Неисправный патрон вызывает мерцание и искрение ламп.

Кстати, существуют еще и бесцокольные лампы – это узкоспециальная разновидность, предназначенная для организации системы освещения автомобиля (лампочки Н10, НВ3, D1S).

РАСШИФРОВЫВАЕМ МАРКИРОВКУ ЦОКОЛЯ

Первая буква указывает на тип цоколя:

E – резьбовой цоколь (Эдисона)
G – штырьковый цоколь
R – цоколь с утопленным контактом
B – штифтовой цоколь (Байонет)

F – цоколь с одним штырьком
      a – цилиндрический штырёк
      b – рифленый штырёк
      c – штырёк специальной формы
S – софитный цоколь
K – цоколь с кабельными соединениями
H – цоколь для ксеноновых ламп
P – фокусирующий цоколь
T – телефонный цоколь
W – основание, в котором электрический контакт с патроном осуществляется непосредственно через токовые вводы, расположенные на стеклянном основании лампы.

Цифры рядом с буквой обозначения цоколя — это наружный диаметр резьбового соединения в миллиметрах или расстояние между контактами в миллиметрах. Например,

GX53, где 53 мм – это расстояние между штырями

Буквы после диаметра (или расстояния) указывают на количество контактных пластин, штырьков или гибких соединений:

s — один контакт
d — два контакта
t — три контакта
q — четыре контакта
p — пять контактов

Для некоторых типов цоколей добавляется еще одна буква, уточняющая:

U – энергосберегающая лампочка;
V – цоколь с коническим концом;
A – автомобильная лампа.

Пример расшифровки цоколя лампы: E14U – лампа энергосберегающая с резьбовым цоколем, диаметром 14 мм.

Если разделять цоколи ламп глобально, то поделить их можно на две группы: резьбовые цоколи и цоколи с поверхностными контактами (штыковые, с утопленным контактом и т. д.)

РЕЗЬБОВОЙ (ИЛИ ВИНТОВОЙ) ЦОКОЛЬ E

Цоколь Эдисона (Edison) — самый популярный вид цоколя. Именно такой цоколь у обычной лампы накаливания. Это самый удобный цоколь для использования и в настоящее время он используется не только в лампах накаливания, но и в светодиодных лампочках и энергосберегающих. Кроме того, лампа с цоколем типа E отличается своими размерами – она имеет малый вес.

Данный вид цоколя встречается в следующих вариациях: Е5, Е10, Е12, Е14, Е17, Е26, Е27, Е40. Но самыми популярными являются Е14, Е27, Е40

Лампы с цоколем E27 — самый распространенный тип цоколя в быту. Лампы с цоколем Е27 чаще всего используются в люстрах, плафонах, настенных и настольных светильниках.

Цоколь E14 — второй по популярности тип цоколя в быту. Лампы с цоколем Е14 в быту часто называют «миньоны» Практически в любой квартире найдется место, где установлены лампы с таким цоколем.

Чаще всего это кухня, туалетная или ванная комната, коридор.

Лампы с цоколем E40 — это самый крупный цоколь с категории типа «E». Чаще всего лампы с цоколем E40 имеют большую мощность и используются в промышленном и уличном освещении.

В Америке стандартные размеры цоколей совсем иные, чем в Европе. Это связано с тем, что там в сети напряжение составляет 110 В. Чтобы нечаянно не вкрутить европейскую лампочку, нужно помнить, что диаметр у них другой: Е12, Е17, Е26 и Е39.

ШТЫРЬКОВЫЙ ЦОКОЛЬ G

В цоколе этого типа используется не винтовая резьба, а штыревая система соединения лампы с патроном. Штыри обеспечивают удержание прибора в патроне, потому что их вставляют в патрон очень плотно. Штырьковый цоколь G используется для разных видов ламп, начиная от маленьких галогенных, заканчивая потолочными люминесцентными. Так как существует множество штыревых цоколей с разницей между контактами всего в несколько миллиметров, то их легко спутать, но делать этого нельзя. Обозначение в цифрах после буквы G соответствует расстоянию в миллиметрах между контактами.

Для цоколей этого типа часто применяются дополнительные обозначения, указывающие на невзаимозаменяемые модификации ламп: U, X, Y, Z. У цоколей G5.3, GX5.3 и GU5.3 разница в длине контактов и их ширине. Именно у GX5.3 и GU5.3 контакты имеют одинаковый размер, но у GU5.3 есть дополнительные пазы на корпусе. GU5.3 используется в лампах рассчитанных на напряжение 12В.

Цоколь G5 устанавливается в трубчатые энергосберегающие люминесцентные лампы с диаметром колбы 12,5 или 16 мм. В бытовых условиях применяются довольно редко.

Цоколь GU5.3 наиболее часто встречается в галогенных и светодиодных лампах типоразмера MR16, которые используются в нишевом освещении, бытовой, декоративной и витринной подсветке. Обычно такие лампы питаются от сети 220V (AC) или 12V (AC/DC). Кстати, среди светодиодных ламп данный цоколь очень популярен.

Лампы с поворотно-штырьковым цоколем GU10 также имеют типоразмер MR16, вставляются в патрон и проворачивают до упора в специальном замке. Поэтому они используются там, где из-за вибрации или внешних воздействий другие лампы могут выпасть. Питание ламп с цоколем GU10 обычно осуществляется от сети переменного тока 220V (AC).

Внешне лампы с цоколями GU10

и GU5.3 различаются только толщиной и внешним видом штырьков.

Цоколь G4 разработан для миниатюрных ламп с корпусом MR11, которые широко используются для декоративного светового оформления благодаря своему яркому точечному свету. В основном это низковольтные лампы для напряжения 12/24В, но встречаются и на 220В (AC). Преимущества этих ламп проявляются, прежде всего, во встраиваемых потолочных светильниках и гибких системах освещения.

Цоколь G6.35 очень похож на предыдущие. Расстояние между штырьками — 6,35 мм.

Питание таких ламп обычно происходит от сети переменного тока 220V(AC).

Цоколь G9 — тоже штырьковый цоколь, в виде двух вытянутых петелек проволоки с расстоянием между штырьками 9 мм. Лампы с цоколем G9 применяются в светильниках акцентного и декоративного освещения, в последнее время часто встречаются в люстрах для дома. Штырьковый цоколь очень удобен в использовании – установка и замена ламп является быстрой и простой.

Цоколь G13 — штырьковый цоколь с расстоянием между штырьками 13 мм. Лампы с данным цоколем чаще всего устанавливаются в светильники типа Армстронг, ЛПО, ЛВО, ЛСП и других.

Трубчатые люминесцентные и светодиодные лампы Т8 имеют одинаковый цоколь

G13 и являются аналогами.

Цоколь G23 — это цоколь с расстоянием между штырьками 23 мм. Лампы с таким цоколем часто используются в настольных лампах, светильниках для душевых и ванных комнат. Цокольные гнёзда таких ламп имеют специальные отверстия для монтажа в обычные настенные светильники.

Цоколь GX53 часто используют для подвесных и натяжных потолков в жилых и офисных помещениях из-за небольшой высоты ламп с таким цоколем (28 мм). Такие лампы также поворачиваются до упора с специальном замке (как лампы с цоколем GU10). Расстояние между центрами штырьков — 53 мм. Лампы с цоколем GX53 обычно работают от сети переменного тока 220V (AC) и не нуждаются в каких-либо трансформаторах. Для подключения таких ламп обычно достаточно подходящего по цоколю светильника, дополнительных патронов не требуется.

Цоколь GX70 — «старший брат цоколя GX53». Он абсолютно аналогичен ему с той лишь разницей, что расстояние между центрами штырьков — 70 мм.

Лампа с цоколем G53 используется в тех областях, где требуется направленное освещение, например, создавать акцентное освещение объектов в торговых залах, ресторанах, в эксклюзивных бутиках и галереях, в помещениях с высокими потолками, для сцены. Лампа с таким цоколем чаще всего используется в светильниках с шарнирным креплением лампы типа «кардан».

Разновидности и типоразмеры штыковых цоколей и их применяемость в различных лампах:

Тип с утопленным контактом (R). Он получил широкое применение главным образом в технике, которая работает с высокой интенсивностью с питанием от переменного тока. Главные представители ламп с цоколем R7s – кварцевые галогенные лампы, которые используют в осветительных установках высокой интенсивности. Такие лампы легкие и маленькие, их используют в сетях переменного тока 220В, 50Гц. Стоит обратить внимание, что после обозначения цоколя R7s, указываются цифры 78 или 118. Они показывают общую длину лампы в мм.

Штифтовой цоколь B. Этот тип цоколей возник в процессе эволюции цоколя Эдисона. Его разработали для того, чтобы ускорить процесс замены лампочек и сделать их более компактными. Характерной его особенностью являются несимметричные боковые контакты, с помощью которых закрепляют лампу в держателе (патроне) в строго заданном положению, например для фокусировки светового потока в автомобильных спиральных лампах «ближнего-дальнего» света.

Софитный цоколь S. Софитный двусторонний цоколь S как правило применяется в светильниках для освещения ванных комнат, подсветке зеркал или для освещения автомобиля и номерных знаков. Контакты в нем расположены симметрично с обеих сторон. Цифрами обозначают диаметр корпуса (S6, S7, S8,5). Например, S19 – это софитный цоколь с диаметром корпуса 19 мм; S14s – это софитный цоколь с диаметром 14 мм и одним контактом.

Фокусирующий цоколь P. Такой тип цоколя применяют в навигационных огнях, кинопроекторах, прожекторах и фонарях. С помощью сборной линзы, которая помещена внутри цоколя, фокусируется световой поток в заданную сторону. Цифры в маркировке типа цоколя обозначают диаметр фокусирующего фланца или части корпуса цоколя, на которой горизонтально устанавливается лампа. Например, цоколь P20d – это фокусирующий цоколь с диаметром фокусирующего фланца 20 мм и двумя контактами.

Телефонный цоколь Т. Такой тип цоколей применяют в основном для подсветки в пультах управления и щитках автоматики. Он оснащен маленькой лампочкой. Цифры означают измеренную по контактным пластинкам внешнюю ширину. Например, цоколь Т5.5 имеет габариты 5,5х30мм, при этом:

диаметр цоколя – 5,5мм
диаметр колбы – 4,8 мм
общая длина лампы – 30 мм

Кабельный цоколь K. Нестандартный цоколь, используемый в некоторых проекционных лампах

Без цокольный тип W. Контакт с патроном происходит прямо через токовые вводы, которые расположены на стеклянном основании лампы. Цифрами обозначена общая толщина стеклянной части с одним токовым вводом. Далее следует знак умножения и ширина основания цоколя в миллиметрах.

На сегодняшний день существует ещё ряд нестандартных цоколей, например, специальные цоколи для ксеноновых ламп, обозначаемые буквой Н и цифрами в соответствии с модификацией.

Ситуация, когда вместо цоколя указывается тип лампы

MR16 (цифры могут быть разные)- стандартный типоразмер галогенных ламп накаливания с отражателем. Как правило, используется штырьковый цоколь (G9, G4, G23 и т. д.).
R50 (цифры – это диаметр лампы)- типоразмер рефлекторных ламп. Их используют для создания направленного света. Как правило, используется резьбовой цоколь — E27 или E14.
2D — это компактные люминесцентные лампы. Колбы ламп выполнены в форме двух дуг. Как правило, используется цоколь G10q или GR8.

отзывы, фото и характеристики на Aredi.ru

Мы доставляем посылки в г. Калининград и отправляем по всей России

1
Товар доставляется от продавца до нашего склада в Польше. Трекинг-номер не предоставляется.
2
После того как товар пришел к нам на склад, мы организовываем доставку в г. Калининград.
3
Заказ отправляется курьерской службой EMS или Почтой России. Уведомление с трек-номером вы получите по смс и на электронный адрес.

Ориентировочную стоимость доставки по России менеджер выставит после оформления заказа.

Гарантии и возврат

Гарантии
Мы работаем по договору оферты, который является юридической гарантией того, что мы выполним свои обязательства.

Возврат товара
Если товар не подошел вам, или не соответсвует описанию, вы можете вернуть его, оплатив стоимость обратной пересылки.

У вас остаются все квитанции об оплате, которые являются подтверждением заключения сделки.
Мы выкупаем товар только с проверенных сайтов и у проверенных продавцов, которые полностью отвечают за доставку товара.
Мы даем реальные трекинг-номера пересылки товара по России и предоставляем все необходимые документы по запросу.
5 лет успешной работы и тысячи довольных клиентов.

Обзор светодиодной лампы GU 5.3 на 12V и 220V МR16

Интернет-магазин sestek.ru прислал на обзор несколько светодиодных ламп GU 5.3 220V MR16 5W производства компании BBK. Бытовая техника производства BBK мне не нравилась, но лампочки у них оказались хорошие.

Конечно, ББК самостоятельно они ничего не разрабатывали, они взяли лучшие образцы, которые есть у китайцев. Похожие продаются на Aliexpress, цена такая же, как в России. Но на Алиэкспресс у них нет гарантии и производитель неизвестен, соответственно, ему не надо беспокоится о качестве.

Содержание

1. Характеристики
2. Цоколь GU 5.3
3. Светодиодные лампы gu 5.3 12v
4. Диммируемые светодиодные лампы gu 5.3 220v
5. Патрон GU 5.3
6. Размеры
7. Световой поток
8. Конструкция
9. Начинка
10. Потребление энергии
11. Нагрев
12. Коэффициент пульсаций света
13. Масса
14. Упаковка
15. Приговор

Характеристики

В обзоре участвует модель BBK M53F в корпусе MR16 на 220В, есть модели и на 12V, отличаются только драйвером. Точечные светодиодные светильники имеют небольшие габариты, поэтому при замене галогенки на светодиодную важно это учитывать.

	BBK M53F
Мощность	5Вт
Световой поток	420лм
Питание	220В
Коэффициент пульсаций	1%
Цветовая температура	3000К
Размеры	50х54
Цоколь	GU 5.3
Индекс цветопередачи	75+
Угол свечения	120
Материал	Алюминий
Срок службы	30,000

Цоколь GU 5.3

В обозначении цоколей используется число, обозначающее расстояние между контактными ножками. В нашем случае это 5,3 мм. Для GU4 это 4 мм.

Цоколь GU5.3

Светодиодные лампы gu 5.3 12v

Пример маркировки 220В и 12В

Основное отличие светодиодных ламп GU 5.3 на 12V от 220V это отсутствие полноценного драйвера, которые стабилизирует питание светодиодов. Чем меньше в конструкции используется комплектующих, тем надежнее получается изделие. Рабочее напряжение наносится вместе с маркировкой на корпусе.

Диммируемые светодиодные лампы gu 5.3 220v

Популярная диммируемая модель Gauss

Диммированные лампы имеют маркировку в инструкции или на коробке. Обычные подключать к диммеру нельзя, скорее всего они просто не будут работать или станут мигать. Если вас интересуют диммируемые светодиодные GU5.3 MR16 220V, то лучше покупать на 12V.

Особенностью лампочек на 220V будет увеличение пульсаций света при изменений яркости. Потому что регулируется напряжение в 220В, а драйвер тока пытается стабилизировать ток на светодиодах. В варианте на 12 вольт регулируется уже стабилизированное напряжение, поэтому пульсаций с частотой 100 Герц совсем не будет.

Navigator GU5.3

В России наибольшим спросом пользуются Gauss и Navigator, Гаусс и Навигатор. Из-за небольших габаритов мощность ограничена, поэтому важен каждый люмен. Чем больше система охлаждения, тем больше должна быть мощность.

Патрон GU 5.3

Мощность светодиодки в корпусе MR16 обычно не превышает 7 ватт, поэтому большой нагрузки на контакты патрона не бывает. Но если патрон низкого качества и контакты в нем плохие, то из-за неплотного прилегания они будут искрить и лампочка выйдет из-из строя.

Такое мне недавно встретилось, пожаловались на плохие BBK, которые в течение недели сгорели. Разобрал патрон GU5.3 и посмотрел на контакты, они были подгоревшие и почерневшие. Всё из-за дешевых китайских светильников, купленных на Aliexpress.

Размеры

Световой поток

Холодная

Измерим количество Люмен у образца в устройстве для измерений. Показания люксметра делим на коэффициент 2.16 и получатся Люмены.

	Холодная	Прогретая
Световой поток	453лм	411лм

Прогретая

При заявленных 420лм получилось 410лм, это отличный результат. Учитывая погрешность, соответствует значению указанному в характеристиках изделия. У половины производителей светотехники реальные характеристики обычно ниже на 10-15%. Только у Европейских брендов, например Philips Osram, параметры бывают на 100% указаны верно.

Конструкция

Это первые лампы, которые собраны на резьбовых соединениях. Конструктивно светодиодка выполнено очень хорошо, когда держишь в руках, то ощущение качественного изделия. Рассеивать фиксируется кольцом из алюминия.

во первых они ничем не пахнет;
основная часть корпуса выполнена из алюминия или силумина;
радиатор очень ребристый;
плотная сборка на резьбе;

Чтобы лампа была хорошей и долго работала, есть 2 варианта:

использовать хороший радиатор;
или хорошие светодиоды с температурой нагрева до 90°-100°.

Начинка

До начинки добраться не удалось, должен скручиваться цоколь. Но цоколь намертво вклеен в радиатор и стронуть его не получилось. Гнётся алюминий, но не откручивается. Установлены 28 светодиодов SMD 3528 по 0,2W или похожей мощности.

Потребление энергии

Энергопотребление оказалось выше, чем указано в параметрах. У других производителей реальная мощность оказывается на 10-15% ниже, попадались даже 30%.

Отличный результат, больше не меньше.

мощность получилась 5,46W при обещанных 5W;
Коэффициент мощности 66.

Нагрев

Температура нагрева, как и ожидалось, оказалась не высокой:

на корпусе 61°;
на светодиодах 68°.

С нагревом тоже всё отлично. У других светодиодок диоды греются до 100°-105° из-за слишком малой системы охлаждения.

Коэффициент пульсаций света

Проверим коэффициент пульсаций на частоте 100Гц прибором Radex Lupin. Поместим образец в картонную коробку с отверстием. Получили значение в 1%, с учетом погрешности это равно 0%. То есть мерцание полностью отсутствует, что говорит о хорошем блоке питание, драйвере.

На графиках вы можете спектр на частоте до 600Гц и форму колебаний этого 1%.

Масса

Упаковка

Приговор

Светодиодная лампа GU 5.3 ББК на 220V в корпусе MR16 показала очень хорошие результаты. Встречаются в продаже не часто, но владелец интернет-магазинах сообщил, что за 1 год продажи BBK не было случаев обмена по гарантии. При одинаковой стоимости с конкурентами качество оказалось гораздо выше, чем у многих популярных производителей в России.

Так как на тестировании у меня были лампочки только из этой серии, то про другой модельный ряд ничего не могу сказать, могут оказаться совершенно другими. Поэтому рекомендую к покупке только эти с открытым алюминиевой системой охлаждения.

Обзорная статья о видах электрических ламп и цоколей

В статье мы рассмотрим основные виды электрических ламп, цоколей и патронов, которые можно встретить в продаже в российских магазинах.

1. Самые распространенные электрические лампы — винтовые лампы накаливания и «энергосберегающие» лампы.

Для таких ламп возможны патроны:

E40 (используются для промышленного применения, например в уличных светильниках)
E27 (обычная лампа, самая распространенная в России)
E14 («миньон», лампа с узким цоколем)
E12 (в Росси мало распространена, в основном используется в дизайнерских светильниках с большим количеством лампочек)
E10 (лампы, используемые в елочных гирляндах советского образца)
E5

Есть еще ряд доступных цоколей, но в нашей стране они практически не применяются в быту.

2. Электрические лампы с патроном Свана (байонет).

Возможны два варианта патрона:

SBC (диаметр 15 мм, применяется в галогеновых лампах низкого напряжения и в лампах накаливания)
ВС (диаметр 22 мм, применяется в лампах накаливания и в натриевых лампах низкого давления)

3.

Флюоресцентные или люминисцентные лампы. Представляют собой трубы имеющие по два контакта (пина) с каждой стороны лампы.

T2 (диаметр 7 мм, имеют разъем W4.3 с «розеткой» с расстоянием 4.3 мм между отверстиями T2 tubes)
T4 (диаметр 12 мм, имеют присоединение G5-расстояние между пинами 5 мм
T5 (диаметр 16 мм, имеют присоединение G5-расстояние между пинами 5 мм)
T8 (диаметр 25 мм, имеют присоединение G13-расстояние между пинами 13 мм)
T12 (диаметр 38 мм, имеют присоединение G13-расстояние между пинами 13 мм)

4. Галогеновые мини лампочки и прожекторные трубки.

Тип ламп G9 предназначен для сетей 220В, а G4 и GY6.35 — для низковольтных.

G4 (расстояние между пинами 4 мм)
GY6.35 (расстояние между пинами 6,35 мм)
G9 (расстояние между пинами 9 мм)
R7s (галогеновые трубки R7s оснащены 7 мм разъемами с каждой стороны)

5. Галогеновые лампочки направленного света.

Лампы GU10 и GZ10 предназначены для сетей 220В, а для низковольтных применяются как правило GU5.3 и GU4.

GU10 (расстояние между пинами 10 мм)
GZ10 (расстояние между пинами 10 мм)
GU5.3 (расстояние между пинами 5,3 мм)
GU4 (расстояние между пинами 4 мм)

Для ламп GU10 и GZ10 есть существенное отличие одной от другой. На GU10 есть фаска вокруг ножки, а у GZ10 угол прямой. Таким образом, GZ10 нельзя использовать в патроне для GU10, а GU10 моджет быть установлена в оба патрона.

6. Лампы накаливания — «дневного света»

S14s (соединение на одном конце лампы)
S14d (соединение в центре лампы)
S15s (соединение на обоих концах лампы)

7. Однотрубные компактные флюоресцентные (люминисцентные) лампы = одна трубка с газом.

G23 (2 пина)
2G7 (4 пина)
2G11 (4 пина)

8. Двухтрубные компактные флюоресцентные (люминисцентные) лампы = две трубки с газом.

G24d-1 (2 пина)
G24d-2 (2 пина)
G24d-3 (2 пина)
G24q-1 (4 пина)
G24q-2 (4 пина)
G24q-3 (4 пина)

Люстрам.ру — ваш гид в мире света.

Флуоресцентная лампа Rekam PL-27W, цоколь GU-10, 27Вт

Обзор

Флуоресцентная лампа Rekam PL-27 со сбалансированным цветом производит мягкий, лишённый тени и широко распространенный свет. Отличный вариант для работы в студии, так как по сравнению с традиционным студийным оборудованием вырабатывает намного меньше тепла и потребляет намного меньше энергии.
Подходит к прибору REKAM Флуоресцентная панель FL-500.

Характеристики

Мощность осветителя в Вт	27
Наличие регулировки мощности	Нерегулируемый
Тип источника света	Постоянный
Бренд	Rekam
Размер индивидуальной упаковки	0. 26 × 0.055 × 0.025 м
Вес в упаковке	0.12 кг

Отзывы

‘), prdu = «/197/»; $(‘.reviews-tab’) .append(loading) .load(prdu + ‘reviews/ .reviews’, { random: «1» }, function(){ $(this).prepend(‘

Лампы светодиодные LED MR16 12V, с цоколем GU5.

Сортировать по:

умолчанию
цене
по наличию

Сортировать по:

умолчанию
цене
по наличию

Светодиодные LED лампы MR16 12V, с цоколем GU5.3

Светодиодные лампы LED MR16 с цоколем GU5.3 используются для точечного освещения и имеют очень привлекательный вид, благодаря чему многие производители рекомендуют использовать их в местах, где люди непосредственно будут визуально контактировать с ними. Основное применения для данного источника света приходится на любые жилые помещения, выставочные залы, а так же освещение различных объектов, где требуется непосредственная фоновая подсветка.

Лампы LED MR16 прекрасно могут генерировать белый свет, тем самым передавая всю цветовую гамму освещаемого предмета. Одной из основных задач данной светодиодной лампы является полная замена и предоставление альтернативы галогенным источникам света. В данной области светодиодная лампа MR16 полостью справилась, поскольку она надёжнее в работе и намного меньше потребляет электроэнергии по сравнению с галогенным устройствами.

Форм-фактор лампы MR16 является очень маленьким, что позволяет пользователю использовать её практически в любых места для точечного свечения. Так же светодиодная лампа обладает цоколем GU5.3 состоящим из двух штырьков, в связи, с чем пользователю требуется всего лишь попасть в патрон. Такое подключение может осуществлять любой человек, и оно способно производиться в труднодоступных местах, даже когда нет прямого визуального контакта с патроном.

Корпус лампы может изготавливаться из различных материалов, и в данном вопросе всё зависит от внедрённых производителем технологий. Освещение объектов, светодиодная лампа MR16 осуществляет путём направленного пучка света, который выходит из источника света под углом 36°. Благодаря конусному исполнению корпуса и специальным отражателям лампы, световой поток, исходящий от диода не распыляется, а выходит пучком из источника света.

Относительно номинальной мощности, лампа может быть 3,30 Вт, 3,80 Вт, 4,50 Вт, 5,30 Вт, 5,60 Вт, 7,50 Вт и 8,20 Вт. А по производительности выдаваемого светового потока LED MR16 может предоставить пользователю от 230 Lm до 621 Lm. Из приведённых технических характеристик, можно ещё раз подчеркнуть, что LED MR16 является намного экономичнее по сравнению с галогенными лампами и при этом не уступает в плане выдаваемого светового потока, а в некоторых случаях и превосходит.

Цветовая температура светового потока светодиодных ламп LED MR16 может быть различной: 2700 К, 4000 К, 5000 К и 6500 К. За счёт такого большого выбора ламп в плане цветовой температуры светового потока, пользователь может подобрать необходимый ему источник света с определёнными параметрами, поскольку для подсветки различного рода объектов могут понадобиться разные лампы.

Светодиодные лампы LED MR16 с цоколем GU5.3 имеют большой функционал и хорошо себя зарекомендовали в решении многих задач связанных с точечным освещением.

Производители электрооборудования

Нажмите на логотип производителя чтобы посмотреть все его товары в этом разделе.

Внимание!
Внешний вид товара, комплектация и характеристики могут изменяться производителем без предварительных уведомлений.
Данный интернет-сайт носит исключительно информационный характер и ни при каких условиях не является публичной офертой,
определяемой положениями Статьи 437 Гражданского кодекса Российской Федерации.
Указанные цены действуют только при оформлении требуемой продукции через форму заказа сайта shop220.ru (корзину).

Типы цоколей ламп

Поиск по названию:

Поиск по артикулу:

Поиск по тексту:

Цена:
от: до:

Выберите категорию
Все »Лампы »»Светодиодные лампы »»»Замена лампы накаливания до 60 Вт.

»»»Замена ламп накаливания до 100 Вт. »»»Замена галогенных ламп »»»Диммируемые светодиодные лампы »»»Мощные светодиодные лампы »»»Декоративные лампы »»»Лампы для холодильников и швейных машин »»»Замена люминесцентных ламп »»»Лампы GX53 и GX70 »»Фитолампы »»Ретро лампы »»Лампы 12 Вольт »»Диско лампа »»Лампы энергосберегающие »»»Аналоги ламп накаливания до 60 Вт. »»»»Теплый свет лампы »»»»Холодный свет лампы »»»Аналоги ламп накаливания до 100 Вт.

»»»»Теплый свет лампы »»»»Холодный свет лампы »»»Аналоги ламп накаливания до 500 Вт. »»»»Теплый свет лампы »»Лампы накаливания »»Лампы люминесцентные »»»Лампы Т4 люминесцентные »»»Лампы Т5 люминесцентные »»»Лампы Т8 люминесцентные »»Лампы галогенные »»»Лампы галогенные декоративные »»»Лампы галогенные G4, GU 5.3, GU10 »»»Блоки защиты галогенных ламп »»Лампы металлогалогенные »»Лампы ртутные и натриевые »Светильники »»Светодиодные светильники LED »»»Потолочные светодиодные светильники »»»»Светодиодный светильник под Армстронг »»»»Встраиваемые светодиодные светильники »»»»Накладные светодиодные светильники »»»»Точечные светодиодные светильники »»»»Крепления для потолочных светильников »»»Настольные светодиодные светильники »»»Прожекторы светодиодные »»»Светодиодные светильники уличного освещения »»»Для ЖКХ »»Для дома »»»Потолочные светильники, люстры »»»»Светильники под лампу накаливания »»»»Люстры »»»»Люминесцентные светильники »»»Настенные светильники, бра »»»»Светильники под лампу накаливания »»»»Люминесцентные светильники »»»Ночники »»»Для ванной и туалета »»»Для кухни »»»Точечные светильники »»»Настольные светильники »»Светильники лофт »»Диско шар »»Для дачи »»Для теплицы »»Для бани и сауны »»Для гаража и подвала »»Для производства »»Для офиса »»Для склада и производства »»Для улицы »»»Кронштейны для уличных светильниов »»Светильники для сада и парка »»Для подсветки »»Для спортивного зала »»Для магазина »»Переносные светильники »»Аварийные светильники »»Аккумуляторные светильники »»Патроны к светильникам »Светодиодная подсветка »»Светодиодная подсветка потолка »»»Светодиодная гибкая лента для помещений на самоклеющейся основе ULS-3528 »»» Светодиодная гибкая лента для помещений на самоклеющейся основе ULS-5050 »»»Светодиодная гибкая герметичная лента ULS-3528 »»»Светодиодная гибкая герметичная лента ULS-5050 »»»Драйверы для светодиодов »»»Контроллеры для управления светодиодными источниками света »»Светодиодная подсветка шкафа »»Электронные трансформаторы »Стабилизаторы напряжения »»Однофазные стабилизаторы напряжения »»Стабилизаторы напряжения напольные, электронные »»Стабилизаторы напряжения настенные, релейные »»Стабилизаторы напряжения настольные »»Стабилизаторы напряжения электромеханические »Низковольтная аппаратура »»Автоматические выключатели »»»Автоматы для проводов сечением до 25мм.

»»»»Для дома, характеристика B »»»»Для дома, характеристика C »»»»Для производства, характеристика D »»»Автоматы для проводов сечением до 35мм. »»»»Для дома, характеристика C »»»»Для производства, характеристика D »»»Автоматы для проводов сечением до 50мм. »»»»Для дома, характеристика C »»»»Для производства, характеристика D »»»Автоматы промышленные ВА88 »»УЗО »»Дифференциальные автоматы »»»Серия АВДТ 63 »»»Серия АВДТ 64 с защитой »»»Дифавтоматы АД12, АД14 »»»Серия DX »»Разрядники, ограничители импульсных перенапряжений »»Выключатель нагрузки (мини-рубильник) »»Предохранители »»»Плавкие вставки цилиндрические ПВЦ »»»Предохранители автоматические резьбовые ПАР »»»Предохранители ППНН »»Контакторы »»»Контакторы модульные серии КМ63 »»»Контакторы малогабаритные КМН »»»Контакторы КМН в оболочке IP54 »»Пускатели ручные »Электроустановочные изделия »»Выключатели »»»Выключатели внутренние »»»Выключатели накладные »»Розетки »»»Розетки внутренние »»»»Серия INARI »»»»Серия LARIO »»»»Серия VATTERN »»»»Серия MELAREN »»»»Розетки, выключатели Legrand Valena »»»Розетки накладные »»»»Серия SUNGARY »»»»Серия BALATON »»»»Серия SAIMA »»Коробки монтажные, подрозетники »»»Монтажные коробки для открытой проводки »»»Монтажные коробки для скрытой проводки »»Удлинители электрические »»»Удлинители бытовые »»»Удлинители силовые »»Сетевые фильтры »»Тройники электрические »»Вилки электрические »»Силовые разъёмы »»»Вилки переносные »»»Розетки стационарные »»»Розетки переносные »»»Розетки стационарные для скрытой установки »»»Вилки стационарные »Щитовое оборудование »»Корпуса к щитам электрическим »»»Для помещения »»»»Пластиковые боксы »»»»»Боксы пластиковые навесные »»»»»Боксы пластиковые встраиваемые »»»»»Бокс КМПн »»»»Металлические корпуса »»»»»Щиты распределительные »»»»»Щиты учётно-распределительные »»»»»Щиты с монтажной панелью »»»»»Щиты этажные »»»»Шкафы напольные »»»»»Сборно-разборные шкафы »»»»»Моноблочные шкафы »»»»»Аксессуары к шкафам »»»Для улицы IP65 »»Электрощиты в сборе »»»Ящики с понижающим трансформатором (ЯТП) »»»Ящики с рубильником и предохранителями (ЯРП) »»»Ящики с блоком «рубильник-предохранитель» (ЯБПВУ) »»»Щитки осветительные (ОЩВ) »»Аксессуры для шкафов и щитов »»»Шина нулевая »»»Шина нулевая на DIN-рейку в корпусе »»»Шина N нулевая с изолятором на DIN-рейку »»»Шина N нулевая, в изоляторе »»»Шина N нулевая на угловых изоляторах »»»Шина соединительная »»»DIN-рейки »Фонарики »»Фонарики налобные »»Фонари прожекторы »»Фонари ручные »»Фонари кемпинговые »»Фонари с зарядкой от сети »»Фонари для охоты »Провод, Кабель »»Кабель »»»Кабель медный NYM (3-я изоляция, еврост.

) »»»Кабель медный силовой ВВГ-нг »»»Кабель медный силовой ВВГ »»»Кабель алюминиевый АВВГ, АВВГп »»»Кабель бронированный »»Провод »»»Провод медный »»»Провод медный осветительный ПУНП, ПУГНП »»»Провод монтажный »»»Провод медный гибкий соединительный ПВС »»»Провод медный гибкий соединительный ШВВП (ПГВВП) »»»Провод медный установочный ПВ »»»Провод водопогружной ( ВВП) »»»Провод алюминиевый »»»Провод телефонный »»»Провод ВВП »Звонки дверные »»Звонки беспроводные »»»1 звонок + 1 кнопка »»»1 звонок + 2 кнопки »»»2 звонка + 1 кнопка »»»1 звонок (вилка 220В) + 1кнопка (батарейка А23) »»Звонки проводные »Системы для прокладки кабеля »»Кабельные каналы »»Гофрированные трубы »»»Аксессуары для труб »»Металлорукав »»»Аксессуары для металлорукава »»»Металлорукав в ПВХ-изоляции »»Труба ПВХ »»»Аксессуары для труб »»Лотки металлические »Климатическое оборудование »»Тепловые пушки и вентиляторы »»»Тепловые пушки »»»Масляные радиаторы »»»Тепловентиляторы электрические »»»»Керамические обогреватели »»»»Спиральные обогреватели »»Охлаждаемся, климатическое оборудование »»»Кондиционеры напольные »Инструмент, расходные материалы »»Инструмент »»Изоляция »»»Термоусаживаемая трубка ТУТнг »»»Изолента »»Клеммы, зажимы »»»Строительно-монтажная клемма КБМ »»»Зажим винтовой ЗВИ »»»Соединительный изолирующий зажим СИЗ »»Хомуты, скобы »»»Лента спиральная монтажная пластиковая ЛСМ »»»Хомут нейлон »»»Хомут полиамид »»»Кабельный хомут с горизонтальным замком »»»Скоба плоская »»»Скоба круглая »Умный дом »»Датчики движения »»Дистанционное управление »»Фотореле

Производитель:
ВсеFamettoGaladLegrandTDMUnielVolpeКМ-ПрофильРесантаРоссияСтарлайтСтройСнаб

Прежде чем купить лампу, рекомендуем обратить пристальное внимание на тип ее цоколя, иначе она может просто не подойти к светильнику.
Давайте попробуем разобраться, какие типы цоколей ламп существуют и что они обозначают.

Все типы цоколей обозначаются согласно единым требованиям ГОСТ.

Например, что обозначает лампа Е27?

Большая буква в обозначениии указывает на тип цоколя:

B — штифтовой цоколь (Байонет)
E — резьбовой цоколь (Эдисона)
F — цоколь с одним штырьком, где

a — цилиндрический штырёк
b — рифленый штырёк
c — штырёк специальной формы

G — штырьковый цоколь

H — цоколь для ксеноновых ламп

K — цоколь с кабельными соединениями

P — фокусирующий цоколь
R — цоколь с утопленным контактом

S — софитный цоколь

T — телефонный цоколь

W — основание, в котором электрический контакт с патроном осуществляется непосредственно через токовые вводы, расположенные на стеклянном основании лампы.

Число, следующее за буквенным обозначением, указывает диаметр соединительной части цоколя или расстояние между штырьками.

Строчные буквы после цифры показывают количество контактных пластин, штырьков или гибких соединений:

s — один контакт
d — два контакта
t — три контакта
q — четыре контакта
p — пять контактов

Иногда к первой букве добавляется еще одна буква, уточняющаяя (для некоторых типов):

U — энергосберегающая лампочка;
V — цоколь с коническим концом;
A — автомобильная лампа.

Пример:

Лампа Е27 — резьбовой цоколь, диаметр соединительной части — 27 мм.

Резьбовой цоколь Е (Эдисона):

Цоколь Эдисона — резьбовая система быстрого соединения лампы с патроном, самый популярный тип цоколя.
Кроме классических ламп накаливания, такой цоколь применяется и в лампах других типов, например в энергосберегающих компактных люминесцентных лампах, галогенных лампах и других.
Обозначение Е хх соответствует диаметру в миллиметрах.

Тип	Диаметр (мм.)	Наименование
E5	5	Микроцоколь (LES)
E10	10	Миниатюрный цоколь (MES)
E12	12	Миниатюрный цоколь (MES)
E14	14	«Миньон» (SES)
E17	17	Малый цоколь (SES) (110 В)
E26	26	Средний цоколь (ES) (110 B)
E27	27	Средний цоколь (ES)
E40	40	Большой цоколь (GES)

Штырьковый цоколь G:

Штырьковый цоколь G использовался ранее только для установки трубчатых люминесцентных ламп. Споявлением новых вилов ламп, для соединения лампы и патрона используются разлиные штырьковые системы.
Цифра обозначает расстояние между контактами.

Буквы U X Y Z указывают на модификацию конструкции. Такие цоколя не являются взаимозаменяемыми!

Обозначение G хх соответствует растоянию в миллиметрах между контактами.

Пример: лампа G13

R — Цоколь с утопленным контактом

Основные представители ламп с цоколем R7s — кварцевые галогенные лампы, которые используются в осветительных установках высокой интенсивности, например в прожекторах.
Такие лампы имеют малые габариты и массу. Используются в сетях переменного тока 220 В, 50Гц.
После обозначения цоколя R7s, указываются цифры: 78 или 118. Они показывают общую длину лампы в мм

Тип	Расстояние между штырьками (мм.)	цоколь	патрон	лампа
R7s	7
R7s	7	Цоколь R7s	патрон R7s	кварцевая галогенная R7s

Софитный цоколь S:

Софитный двусторонний цоколь S как правило применяется в светильниках для освещения ванных комнат, подсветке зеркал или сценическом оборудовании. Цифрами обозначают диаметр корпуса (S6, S7, S8,5).

Фокусирующий цоколь P:

Применяется для прожекторов, фонарей, кинопроекторов, навигационных огней и т.д. Этот цоколь лампы накаливания содержит в себе сборную линзу, которая и направляет поток света в нужную сторону. Цифры обычно обозначают диаметр фокусирующего фланца или части цоколя, на которой горизонтально устанавливается лампа.

Телефонный цоколь Т:

Эти цоколи подходят лампочкам подсветки, пультов, мнемосхем и т.д. Цифры означают измеренную по контактным пластинкам внешнюю ширину.

Цоколь типа W:

В случае такого цоколя контакт с патроном происходит прямо через токовые вводы, которые расположены на стеклянном основании лампы. Цифрами обозначают общую толщину стеклянной части с одним токовым вводом. Далее следует знак умножения и ширина основания цоколя в миллиметрах.

На сегодняшний день существует так же ряд нестандартных цоколей, используемых в некоторых проекционных лампах, цоколь с кабельным соединением (К), а так же специальные цоколи для ксеноновых ламп, обозначаемые буквой Н и цифрами в соответствии с модификацией.

В некоторых случаях вместо типа цоколя указывается тип лампы.

MR16 (цифры могут различаться) — стандартный типоразмер галогенных ламп накаливания с отражателем.
Обычно, цоколь используется штырьковый (типа G).

R50 (цифры показывают диаметр лампы)- типоразмер рефлекторных ламп.
Они служат для создания направленного света.
Цоколь типа E (резьбовой).

2D — это компактные люминесцентные лампы.
Колбы ламп выполнены в форме двух дуг.
Цоколь G10q или GR8.

Подробнее про виды ламп

Колбные лампы

Представляют собой лампы в виде стеклянной трубки.
Различаются по диаметру и по типу цоколя, имеют следующие обозначения:

T5 (диаметр 5/8 дюйма=1.59 см),
T8 (диаметр 8/8 дюйма=2.54 см),
T10 (диаметр 10/8 дюйма=3.17 см),
T12 (диаметр 12/8 дюйма=3.80 см).

Подробнее про лампы Т8

Рекомендуем также посмотреть:

Обозначение ламп

Какие светодиодные лампы лучше

Энергосберегающие лампы — вредны или нет?

Как выбрать хороший стабилизатор напряжения

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

ЯМР

показывает, что пары оснований GU, фланкирующие внутренние петли, могут принимать различные структуры.

Abstract

Термодинамика РНК играет важную роль в определении 2D и 3D структур РНК. Внутренние петли последовательности, 5’-GMNU / 3’-UNMG, относительно нестабильны термодинамически. Здесь пять GU фланкированных внутренних петель 2 × 2 нуклеотидов были структурно исследованы, чтобы выявить детерминанты их нестабильности. Исследованные внутренние петли: 5′-GCAU / 3′-UACG, 5′-UUCG / 3′-GCUU, 5′-GCUU / 3′-UUCG, 5′-GUCU / 3′-UCUG и 5′- GCCU / 3′-UCCG.Двумерные спектры ЯМР указывают на отсутствие спаривания оснований вобуляции GU в 5’-GCUU / 3’-UUCG, 5’-GUCU / 3’-UCUG и 5’-GCCU / 3’-UCCG. Петля 5’-GCUU / 3’-UUCG имеет необычную конформацию пар оснований GU, в которой карбонил U’s O2 образует разветвленную водородную связь с протонами амино и имино G. Внутренняя петля 5’-GUCU / 3’-UCUG демонстрирует смещенную конфигурацию, в которой пары GC фланкируют пару U-U, а несколько U находятся в быстром обмене между положениями внутри и снаружи спирали. Напротив, 5’-GCAU / 3-UACG и 5’-UUCG / 3’-GCUU оба имеют ожидаемые пары оснований колебания GU, фланкирующие внутреннюю петлю.Очевидно, пары оснований GU, фланкирующие внутренние петли, с большей вероятностью обнаруживают атипичные структуры по сравнению с парами оснований Watson-Crick, фланкирующими внутренние петли. Это кажется более вероятным, когда G пары GU находится на расстоянии 5 футов от петли. Такие необычные структуры могут служить в качестве элементов распознавания для биологической функции и в качестве ориентира для методов предсказания структуры.

ВВЕДЕНИЕ

Улучшенное предсказание трехмерной структуры РНК зависит от соответствующих экспериментально определенных структур для проверки достоверности предсказанных структур.В целом, предсказание de novo трехмерной структуры РНК значительно отстает от точности предсказания трехмерной структуры белка. ¹ Частично это связано с неточностями в неканонических регионах. ¹ В отличие от взаимодействий Уотсона-Крика, которые обрабатываются с поразительной точностью, физика неканонических взаимодействий до конца не изучена. Огромное разнообразие ² неканонических регионов делает их предсказание особенно трудным, и более полное понимание этих регионов может способствовать лучшему предсказанию трехмерной структуры и динамики.

Термодинамика РНК дает понимание как вторичной структуры, так и индивидуальных оснований. Многие неканонические элементы вторичной структуры имеют экспериментально определенную термодинамику. Для обычных элементов вторичной структуры, таких как внутренние петли два по два нуклеотида (2 × 2 нт), термодинамика зависит от последовательности. ^3–7 Стабильность внутренних петель 2 × 2 нт зависит как от идентичности неканонических пар оснований, так и от взаимодействий между петлей и каноническими фланкирующими парами.Когда внутренние петли размером 2 × 2 нт фланкируются парами оснований GU, она имеет тенденцию быть менее стабильной, чем такая же внутренняя петля, фланкированная парами оснований AU / UA или GC / CG. ^{4, 7}

пары оснований GU повсеместно встречаются в структуре РНК. ^{8, 9} Это, безусловно, самая распространенная пара оснований, не относящаяся к Ватсону-Крику. Наиболее распространенной ориентацией пары оснований GU является пара оснований цис-колебания, в которой граница Уотсона-Крика как G, так и U взаимодействует друг с другом, образуя две межосновные водородные связи (). ⁸ Важность пар колебаний GU в биологии хорошо задокументирована. ⁹ Например, пара GU играет важную роль в саморасщеплении рибозима HDV. ^{10, 11} Однако обычное колебание — не единственная конформация, которую может принять пара оснований GU (). Раздвоенные пары GU наблюдались в нескольких случаях. ^{12, 13} В этих парах карбонил U’s O2 вставляется между протонами G-амино и имино (). Точно так же в кристаллических структурах и структурах ЯМР также наблюдался другой тип разветвленной пары GU, в которой карбонил U’s O4 вставляется между протонами G-амино и G-имино ().Эти возможные конформации GU иллюстрируют пластичность спаривания G-U. Из-за их редкости в описываемых структурах мало что известно о термодинамике или контексте последовательности для этих пар не колеблющегося GU.

Структура нескольких различных пар оснований GU. ² (A) пара колебаний cWW GU, (B) пара раздвоенных оснований cWS GU, как в структуре рибосомы (код PDB: 1FFK, остатки 966–1002), ¹⁴ (C) пара раздвоенных оснований tWH GU, как в 5S рРНК (код PDB: 364D, остатки 74–102), ¹² (D) пара tSW GU, как в шпильке UUCG (код PDB: 1HLX, остатки 9–12), ¹³ (E) tWW Пара обратных колебаний (Код PDB: 1FFK, остатки 1966–1970) ¹⁴. Примечание: сахара исключены из изображений пары оснований, несмотря на участие некоторых сахаров в водородных связях с основанием.

Здесь структуры дуплексов, содержащих 2 × 2 нт внутренних петли, фланкированных парами GU, были исследованы с помощью ЯМР для определения причин их нестабильности. Изучаемые внутренние петли: 5′-GCAU / 3′-UACG, 5′-UUCG / 3′-GCUU, 5′-GCUU / 3′-UUCG, 5′-GUCU / 3′-UCUG и 5′-GCCU. / 3′-UCCG. Измеренные параметры ближайшего соседа для исследованных внутренних шлейфов находятся в диапазоне от 3,58 до 5.37 ккал / моль при 37 ° C. ^{4, 7} Обсуждаемые здесь внутренние петли 2 × 2 нт все считаются внутренними петлями первой категории, то есть петлями, которые вряд ли будут иметь неканоническую пару с двумя прочными водородными связями между основаниями. ¹⁵ Двумерный ЯМР выявил пары GU, граничащих с внутренними петлями, которые отклонились от ожидаемой структуры колебания GU для 5′-GCUU / 3′-UUCG, 5′-GUCU / 3′-UCUG и 5′-GCCU / 3 -UCCG. Обе петли 5′-UUCG / 3′-GCUU и 5′-GCAU / 3′-UACG показали ожидаемую пару GU, фланкирующую внутреннюю петлю, показывая, что не все пары GU, фланкирующие внутренние петли категории 1, не могут образовать пару колебаний. .Измененные паттерны взаимодействия многих пар GU, фланкирующих соответствующую внутреннюю петлю, помогают объяснить предыдущие термодинамические измерения и могут помочь в определении того, где с большей вероятностью могут возникнуть пары GU без колебаний.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение РНК

Последовательности были выбраны из предыдущих экспериментов по плавлению. ^{4, 7} олигонуклеотидов РНК были приобретены у Dharmacon. Последовательности были: ((5-CGGGCAUCCG) ₂, GCAU для краткости), (5′-CGCAUUCGACGC / 3′-GCGUGCUUUGCG, UUCG для краткости), (5′-CGCAGCUUACGC / 3′-GCGUUUCGUGCG для краткости) (5′-CGCAGUCUACGC / 3′-GCGUUCUGUGCG, сокращенно GUCU) и (5′-CGCAGCCUACGC / 3′-GCGUUCCGUGCG, сокращенно GCCU).РНК растворяли в буфере ЯМР, состоящем из 80 мМ NaCl, 50 мМ NaH ₂ PO ₄ и 0,05 мМ Na ₂ EDTA (pH = 6,1–6,4). Обмен на D ₂ O осуществляли лиофилизацией. Каждый несамокомплементарный и самокомплементарный дуплексы использовали концентрацию дуплекса приблизительно 1 мМ (таким образом, отдельные нити в несамокомплементарном дуплексе составляли приблизительно 1 мМ каждая, а общая концентрация нити составляла приблизительно 2 мМ). Образцы для спектров, в которых присутствовал Mg ²⁺, были созданы путем добавления MgCl ₂ с получением конечной концентрации 2 мМ Mg ²⁺ (см. Рисунки S1–3).Спектроскопия ЯМР

Спектры ЯМР

собирали на спектрометрах Varian Inova 500 или 600 МГц. Одномерные спектры получены с помощью импульса подавления спинового эха 1–1 в воде. ¹⁶ Двумерные спектры в H ₂ O были получены с использованием импульса WATERGATE с переворотом для подавления воды. ^{17, 18} Типичный набор экспериментов для каждой последовательности включал эксперименты NOESY со временем смешивания 50, 175 и 400 мс, а также эксперимент TOCSY со временем смешивания 32 мс.Для (5′-CGGGCAUCCG) ₂ и 5′-CGCAGCUUACGC / 3′-GCGUUUCGUGCG, ¹³ C- ¹ H повышенная чувствительность HSQC (при естественном изобилии) и ³¹ P- ¹ H Спектры HETCOR были собраны, чтобы помочь определить остатки сахара. Двумерные данные обрабатывали с помощью NMRPipe. ¹⁹ NMRFAM-SPARKY использовался для отображения и назначения протонов в наборах данных 2D. ²⁰ Отнесение протонов осуществлялось описанными ранее методами. ²¹ Таблицы химических сдвигов / назначений доступны во вспомогательной информации (Таблица S1–5).

Создание ограничений

Ограничения генерировались из назначенных резонансов NOE при временах смешивания 50 мс или 175 мс. По возможности, расстояния NOE определяли с использованием отношения объемов 1 / r ⁶ NOE с объемами кросс-пиков цитозина и урацила H5-H6 в качестве эталонного расстояния (2,45 Å). При расчете объемов NOE использовался метод интегрирования суммы по прямоугольнику в NMRFAM-SPARKY. ²⁰ Однако спектральное перекрытие препятствовало измерению многих таких пиков, и поэтому большинство объемов NOE были разделены на 4 категории: сильные (1.5–2,7 Å), средний (2,0–3,5 Å), слабый (2–4,7 Å) и очень слабый (обычно используется для пиков спиновой диффузии, 2,5–6 Å). Двугранные углы были ограничены типичными значениями РНК А-формы, где данные указывали на канонические пары, и для углов с прямым доказательством скалярного связывания. ²² Таблицы S6–8 содержат ограничения, используемые при моделировании отжига.

Simulated Annealing

Стартовые структуры РНК А-формы были получены с использованием NUCGEN. ²³ Структуры были получены с ограничениями ЯМР в неявном растворителе Generalized Born.²⁴ Алгоритм имитации отжига использовал 3 фазы в течение 100 пс. Сначала РНК выдерживали при 3000 К в течение 5000 шагов (5 пс). Затем РНК линейно снижалась до 100 К за 93000 равных температурных шагов (93 пс). Наконец, РНК выдерживали при 0 К в течение 2000 шагов (2 пс). Силовые константы, использованные для дистанционных и двугранных ограничений, составляли 30 ккал / (моль * Å ²) и 30 ккал / (моль * рад ²), соответственно. Веса, приложенного к ограничителям, составляли 0,1 для первой фазы моделирования отжига и 1. 0 для двух заключительных фаз. После того, как набор структур был сгенерирован, структуры были отсортированы по энергии сдерживания. Из набора структур без нарушений расстояния> 0,1 Å 20 структур с наименьшей энергией удержания были сохранены в окончательном ансамбле. Пимол использовался при анализе и создании фигур на основе ансамблей структур. ²⁵ Структурную статистику для трех смоделированных структур внутреннего контура можно увидеть в Таблице S9.

Прогнозирование трехмерной структуры с помощью ROSIE

Трехмерные структуры были предсказаны с помощью протокола FARFAR (RNA De Novo) сервера ROSIE.^26–29 Были предсказаны структуры, для которых была определена структура на основе ЯМР: (5’-CGGGCAUCCG) ₂, 5’-CGCAUUCGACGC / 3’-GCGUGCUUUGCG и 5’-CGCAGCUUACGC / 3’-GCGUUUCGU. Испытания были выполнены с учетом химических сдвигов и без учета незаменяемых протонов. В каждом прогоне была предоставлена вторичная структура, и пары GU были отмечены как часть цикла. Две опции « Разрешить выпуклость» и «Использовать обновленное (2012) силовое поле» были включены для каждого отдельного прогона.Для 5’-CGCAGCUUACGC / 3’-GCGUUUCGUGCG в каждом прогоне рассчитывали 1000 структур. Для двух других последовательностей в каждом отдельном прогоне рассчитывали 200 структур. Структуры с наименьшей энергией из ROSIE сравнивали со структурами из моделируемого отжига путем расчета значений RMSD с использованием модели, полученной методом ЯМР с наименьшей энергией (только 8 остатков внутреннего контура) в качестве эталона.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Самокомплементарный дуплекс GCAU

Дуплекс GCAU, (5’-CGGGCAUCCG) ₂, самокомплементарен парам оснований GU, фланкирующим две пары CA ().Спектр имино-протонов для GCAU имеет четыре индивидуальных резонанса (). Резонансы при 12,67 и 12,74 м.д. относятся к протонам G-имино стволовых пар GC (), G2-C9 * и G3-C8 *, соответственно, где * представляет собой другую цепь. Иминопротон G4 (11,09 м.д.) был отнесен большим кросс-пиком к амино G4 и кросс-пикам для C5h2 ’и C8 * h2’. Иминопротон U7 () чрезвычайно широкий и, следовательно, вероятно, сильно зависит от обмена с водой. Диагональный пик для U7 в спектре NOESY длительностью 50 мс очень слабый, но его кросс-пик с G4 более сильный ().Последний кросс-пик соответствует паре колебаний G4-U7 *. ³⁰ Близость этой пары к внутренней петле может позволить мгновенное раскрытие спирали, позволяя имино-протону U7 обмениваться с водой.

1D ЯМР-спектры дуплексов, содержащих 2 × 2 внутренних петли, фланкированных «парами» GU.

Imino 2D NOESY-спектр (50 мс) дуплекса GCAU, выявляющий пары колебаний GU (кросс-пики отмечены красным).

Структуры пар CA устанавливаются несколькими NOE (рис. S4) в спектре NOESY 75 мс.Аминопротоны C5, C5h51 и C5h52, оба показывают NOE для A6 * h3 и аминогруппы A6 *. Аминорезонансы аденина идентифицируются NOE (вероятно, из-за спиновой диффузии) к A6h3. Смоделированный дуплекс () имеет пару СА с одинарной водородной связью между амино C5 и A6N1 (). Если бы цитозиновые аминокислоты могли быстро вращаться и не были связаны водородными связями, тогда был бы только один резонанс C5-амино. Таким образом, эта водородная связь дополнительно подтверждается двумя аминорезонансами C5. Напротив, аминокислоты A6 имеют только один резонанс, что указывает на то, что они не связаны водородными связями.Это отражено в смоделированной структуре пары CA ().

(A) Структура дуплекса GCAU. Внутренняя петля окрашена в голубой цвет, а прилегающие стебли — в красный цвет. (B) Структура пары оснований C-A с одинарной водородной связью (cWW). Красная пунктирная линия представляет собой одинарную водородную связь, а пурпурные пунктирные линии представляют два наблюдаемых ННЭ.

Несамокомплементарный дуплекс UUCG

Дуплекс UUCG (5’-CGCAUUCGACGC / 3’-GCGUGCUUUGCG) не является самокомплементарным с внутренним контуром 5’-UUCG / 3’-GCUU (и).Спектр протонов 1D имино имеет химические сдвиги, аналогичные химическим сдвигам других несамокомплементарных дуплексов, содержащих аналогичную основу (-). Очевидно, дуплексы в — имеют сходные стволовые структуры, как и ожидалось, исходя из их последовательностей. В отличие от GCAU (), пары колебаний GU, прилегающие к внутренней петле, показали сильные диагональные пики имино, а также сильные кросс-пики (U5h4-G20h2 и U17h4-G8h2,). Модель с ограничением ЯМР точно воссоздает водородную связь пар колебаний GU, как это видно на рис.

(A) Предполагаемая вторичная структура дуплекса UUCG. (B) 2D имино-спектр NOESY дуплекса UUCG, который включает два пика колебания GU, показанные красным / подчеркнутым цветом. Цветные NOE в спектре NOESY соответствуют имино-имино NOE, показанным во вторичной структуре в углу панели B. (C) пики CH5-h52 / h51 для внутреннего контура. Для каждой амино можно увидеть два резонанса, вероятно, из-за наличия водородной связи при образовании пар UC.

(A) Пара колебаний U5-G20 в дуплексе UUCG.(B) Смоделированная неканоническая парная структура cWW U6-C19. Две потенциальные водородные связи показаны красными пунктирными линиями. (C) Ансамбль дуплексных моделей для дуплекса UUCG.

Внутренний контур UUCG содержит две пары UC. Оба цитозина внутренней петли, C7 и C19, имеют два аминорезонанса, каждый из которых имеет перекрестный пик со своим собственным CH5 (). Количество резонансов C7 и C19 подразумевает, что эти аминокислоты связаны водородными связями, как видно в других парах UC. ^{31, 32} Канонические перекрестные пики A-формы видны для всех остатков внутри петли и рядом с ней, что указывает на то, что остатки петли находятся внутри спирали и имеют конформацию, подобную A-форме.Однако, несмотря на указание на образование пар UC, иминорезонанс для U6 или U18 в одномерном спектре не наблюдается (). Очевидно, протоны U-имино внутри петли легко обмениваются с водой. Моделирование этой пары () дало более замкнутую конфигурацию пар UC, чем было смоделировано ранее ³¹ или замечено. ³² В частности, водородная связь между U6 / U18 h4 и C19 / C7 N3 in отсутствует или заменена мостиковым водным мостиком. ^{31, 32} В отсутствие явной воды во время моделирования пара UC не может быть опосредована водным мостиком, как показано в работе Holbrook et al.Кристальная структура. ³² Кристаллическая структура, однако, не исключает существования спаривания UC с двумя водородными связями (). Возможно, что пара находится в динамическом равновесии в растворе между двумя возможными парными структурами CU. Смоделированная структура UUCG имеет аминоводородные связи U6 / U18 O4 — C19 / 7, согласующиеся с другими структурами, ^{31, 32}, даже несмотря на то, что эта водородная связь не ограничивалась. Однако важно отметить отсутствие межбазовых NOE между C7 / C19 и U18 / U6 при рассмотрении моделируемой структуры.

Несамокомплементарный дуплекс GCUU

показывает предсказанную вторичную структуру и одномерный имино-протонный спектр для несамокомплементарного дуплекса GCUU, содержащего внутреннюю петлю 5’-GCUU / 3’-UUCG. Большинство стеблей формируется, как ожидалось, с парами оснований GC / AU, отображающими ожидаемый канонический набор NOE (и). Однако в 2D-спектрах заметно отсутствуют пики, соответствующие колебаниям GU для G5 / U20 и G17 / U8 (). Ни один из широких пиков ниже 12 м.д. в одномерном спектре () не дает перекрестного пика имино-имино.Эти широкие пики не наблюдаются в 2D-спектрах до температуры ниже 15 ° C, при которой все пики становятся чрезвычайно широкими. Таким образом, нельзя было сделать однозначного определения этих широких пиков имино. При более высоких температурах (Рисунок S5) дуплекс начинает плавиться, и новые пики не появляются.

(A) Прогнозируемая структура GCUU. Стрелки голубого цвета указывают на остатки, которые демонстрируют кросс-пики h2’-h2 ’NOESY, указывающие на образование раздвоенной пары GU. (B) 2D имино-спектр, который показывает структуру за пределами внутренней петли, сформированной, как ожидалось, несмотря на отсутствие спаривания GU вобуляции в области петли.(C) NOE между амино G5 и U20h2 ’, согласующийся с образованием раздвоенной пары. (D) зона ходьбы h2’-h2 ’для обеих прядей красного и зеленого цветов. Поперечные резонансы h2’-h2 ’, возникающие в результате сужения малой канавки, показаны голубым цветом.

Несмотря на отсутствие кросс-пика колебания GU, кросс-пики амино G5 дают некоторое представление о схеме спаривания для пар GU. В спектре NOESY 400 мс амино G5 показывает NOE для C6h2 ’, U21h2’ и U20h2 ’(и). В парах колебаний GU и подобных структурах, ^{14, 33, 34,} амино G и h2 ’парного U находятся на расстоянии <5 Å друг от друга, что может привести к NOE.В предыдущих спектрах ЯМР ^{35, 36} и в дуплексе UUCG () этот потенциальный NOE очень слабый или отсутствует. Таким образом, отсутствие имино-имино NOE G5-U20 показывает, что пара G5-U20, вероятно, не находится в паре колебания, но амино G5 к U20h2 ’NOE подразумевает конформацию, подобную колебанию. К сожалению, соответствующая амино G17 для G8h2 ’NOE не может быть локализована.

Некоторые колеблющиеся структуры GU () связаны с суженной малой канавкой для остатков, окружающих пару GU.^{14, 33} Это сужение в определенных парах GU было предсказано при молекулярно-динамическом моделировании внутренней петли 5’-GAGU / 3’UGAG. ³³ Сужение малой бороздки сближает протоны h2 ’соседних остатков, которые обычно находятся на расстоянии более 5 Å. Более конкретно, если малая бороздка сужена в дуплексе GCUU, то ожидается, что атомы h2 ’будут находиться в пределах 5 Å друг от друга для C6 / U20, U7 / U19 и U8 / C18. В D ₂ O, ННЭ C6h2’-U20h2 ’и U8h2’-C18h2’ можно четко увидеть () и отличить от других пиков в пределах диапазона h2 ’- h2’.Потенциальный кросс-пик U7h2’-U19h2 ’нельзя увидеть из-за перекрытия химических сдвигов h2’, как и ожидалось, из-за псевдосимметрии пар CU. Подобные перекрестные цепи h2 ’к h2’ NOE не наблюдались в дуплексах 5’-GCAU / 3’-UACG или 5’-UUCG / 3’-GCUU.

Интересно, что ожидаемая симметрия пар GU отсутствует. Сахар U8 имеет 30-40% C2 ’эндо-характер, на что указывает скалярная связь 3,5 Гц между h2’ и h3 ’. Это контрастирует с U20, где более слабая связь h2’-h3 ’равна 2.0 Гц. Дополнительным доказательством асимметрии в области петли является небольшой NOE U7h2’-A9H8, указывающий на то, что U8 может иногда отрываться от спирали. Однако соответствующий пик, указывающий на то, что U20 может перевернуться, отсутствует. Эта информация, вместе с тем фактом, что амино G17 не наблюдается, в то время как G5 наблюдается, указывает на то, что две пары GU не эквивалентны. Одной из возможных причин этого может быть лежащая в основе последовательность, окружающая каждую пару GU. U20 находится в середине длинного отрезка пирмидинов (C18-U19- U20 -U21), тогда как U8 имеет соседний пурин (C6-U7- U8 -A9).Для двух пар GU, граничащих с внутренней петлей, могут существовать дифференциальные взаимодействия стекирования из-за различий в окружающей последовательности.

Моделирование дуплекса GCUU () дало структуры с раздвоенными парами GU, подобными тем, которые наблюдаются в минорной структуре GAGU и рибосоме (и). ^{14, 33} Малая канавка была сужена в смоделированных структурах из-за ограничений расстояния, установленных на C6h2’-U20h2 ’и U8h2’-C18h2’ (ограниченных с нижней границей 3 Å и верхней границей 5 Å).Средние расстояния для C6h2’-U20h2 ’и U8h2’-C18h2’ в окончательном структурном ансамбле составляют 4,1 Å и 4,2 Å соответственно (). Эти расстояния контрастируют со значениями в стержне, где аналогичные расстояния h2′-h2 ‘в среднем составляют 6,4 Å для нижнего стержня (G2h2′-G24h2′, C3h2’-C23h2 ‘и A4h2′-G22h2′) и 6,7 Å для верхнего. ствол (C10h2’-U16h2 ‘, G11h2′-G15h2′, C12h2’-C14h2 ‘). G5h2’-U21h2 ’и A9h2’-G17h2’ имеют значения, промежуточные между значениями, наблюдаемыми для стержней и петель (5,3 ± 0,6 Å и 5,5 ± 0,4 Å, соответственно), показывая, что эти остатки могут быть там, где начинается отклонение бороздки.Видны небольшие NOE, которые могут быть связаны с узкой канавкой на этой промежуточной ширине (G5h2’-U21h2 ’и A9h2’-G17h2’,).

(A) Набор дуплексных моделей для дуплексного блока GCUU. (B) Усредненные по ансамблю расстояния h2’-h2 ’указаны для соответствующей части дуплекса (цветовая кодировка дуплекса с правой стороны). В трехмерной структуре три соединения h2’-h2 ’показаны черными пунктирными линиями в структуре справа. (C) cWS GU Раздвоенная пара, полученная в результате моделирования GCUU. Красные линии указывают на присутствие Н-связи, а фиолетовые линии указывают на наблюдаемую NOE (D) смоделированную пару cWW CU дуплекса GCUU.

Моделирование выявило пары CU, ориентированные с помощью водородных связей имино-протонов U7 и U19 h4 с атомами C18 и C6 N3 соответственно (). Подобно парам UC в UUCG (), вполне вероятно, что фактическая структура пар CU более открыта, чем наблюдаемая в модели GCUU. Отсутствие идентифицируемых резонансов из-за U7 или U19 h4 указывает на то, что имино-протоны обмениваются с водой. Кристаллическая структура Холбрука и др. показывает образование пар UC, опосредованное водой между U h4 и C N3, что согласуется с тем, что U7 и U19 способны легко обмениваться с водой.³² Кроме того, водородная связь возникает между аминопротонами C18 / C6 и карбонилом U7 / U19 (O4) (), как это видно в других парах CU. ^{31, 32} Несмотря на отсутствие данных NOE относительно пар U7-C18 и C6-U19, силовое поле создает пару UC, аналогичную ранее наблюдаемым парам UC.

Моделирование также показывает, что может существовать слабая Н-связь между амино G5 и O2 ’сахара U20 (). Среднее расстояние акцептор-донор по 20 моделям составляло 3,8 Å, что указывает на наличие слабой водородной связи.³⁷ Эта ориентация подтверждается существованием амино G5 по отношению к U20h2 ’NOE, что сближает амино G5 в пространстве с сахаром U20. Модель содержит O2 ’U20, участвующий в потенциальной водородной связи, но гидроксильный протон U20 не может быть однозначно идентифицирован.

Несамокомплементарный дуплекс GUCU

Несамокомплементарный дуплекс GUCU (5’-CGCAGUCUACGC / 3’-GCGUUCUGUGCG,) был назначен обычным образом. Одномерный спектр () означает, что дуплекс имеет структуру ствола, аналогичную таковой с той же последовательностью ствола (-).За исключением пары A4-U21, сформировались компоненты штока GC и AU. Как и в случае внутренней петли 5’-GCUU / 3’-UUCG, спектры ЯМР для 5’-GUCU / 3’-UCUG не показали кросс-пика имино-имино, ожидаемого для пар колебаний GU (). В одномерном спектре дуплекса GUCU () при 10 ° C отсутствовали резонансы из области петли (G5, U6, U8, G17, U18 и U20). Очевидно, эти резонансы были слишком широкими, чтобы их можно было наблюдать.

(A) 2D NOESY имино-область без NOE, которые могут указывать на пары оснований колебания. (B) NOE, указывающие на то, что U8 находится внутри, могут вылететь из спирали.(C) Прогнозируемая структура дуплекса GUCU. (D) Модель вторичной структуры для дуплекса GUCU. Все красные буквы U нельзя сбрасывать одновременно. Пары среднего GC могут не всегда присутствовать. (E) и (F) Модельные дуплексы (GUCC и GUC), созданные для сравнения химических сдвигов остатков внутренней петли с таковыми из дуплекса GUCU.

В дуплексе GUCU есть свидетельства того, что U8 иногда выворачивается из спирали. Прямой NOE наблюдается между C7h2 ’и A9H8 в спектре NOESY 400 мс (). Этот пик сопровождается ожидаемым каноническим пиком между U8h2 ’и A9H8 ().Скалярная связь h2’-h3 ’для U8 составляет 4 Гц, что указывает на то, что сахар является динамическим с эндо-характером C2’ около 40%. Также наблюдается NOE между C7h3 ’и U8H6, который представляет собой канонический пик A-формы, которого нельзя было бы ожидать, если бы U8 всегда был отключен. ³⁸ Поскольку U8 имеет только один набор резонансов, происходит быстрый обмен между конформациями с U8 внутри и вне спирали. Если C7h2′-A9H8 NOE присутствует только тогда, когда U8 переворачивается, и если C7h2′-A9H8 находится на таком же расстоянии от большинства последовательных перекрестных пиков Уотсона-Крика nh2 ‘- (n + 1) H6 / H8, тогда приблизительный процент перевернутой структуры можно получить, разделив объем NOE C7h2’-A9H8 на среднее значение объемов из стержня Watson-Crick nh2 ‘- (n + 1) H6 / H8 NOE.При таких предположениях U8 отключается примерно в 40% случаев.

Судя по псевдосимметрии дуплекса, вполне вероятно, что U20 тоже выйдет из строя. Однако потенциальный NOE между C19h2 ’и U21H6 не может наблюдаться из-за перекрытия. Интересно, что наблюдается небольшой кросс-пик NOE между U20h2 ’и G22H8, что согласуется с частичным выходом U21 из дуплекса (Рисунок S6). Это неожиданно, потому что предсказанная вторичная структура имеет пару оснований A4-U21.Способность U21 разворачиваться также подтверждается отсутствием имино-резонанса U21, ожидаемого для пары оснований A4-U21 ().

Химические сдвиги аминогрупп C7 и C19 напоминают цитозиновые аминокислоты в парах Watson-Crick GC (см. И S4). В одномерном спектре имино-протонов () нет доказательств наличия дополнительных пар оснований GC, но это может быть связано с обменом имино-протонов с водой внутри динамической внутренней петли. Это наблюдение оставило две возможные вторичные структуры для дуплекса (и): (а) одну, в которой две пары UC фланкированы парами GU, и / или (б) дуплекс с двумя неожиданными парами GC, фланкирующими центральную пару U6-U18, где U8, U20 и U21 имеют возможность выйти из дуплекса.

Таблица 1.

Сравнение внутренних химических сдвигов цитозина между GUCU (/) и GUCC ().

GUI 6,95 был разработан самокомплементарный дуплекс (GUCC), (5′-GCAGUCCUGCA) ₂, который содержит пары оснований Watson-Crick GC, фланкирующие тандемное несоответствие UC (). Размещение пар GC рядом с тандемным несоответствием UC вызывает формирование тандемных пар UC при сохранении G 5 ’U.Это позволяет сравнивать химический сдвиг между цитозиновыми аминокислотами в паре UC в 5’-GUCC / 3’-CCUG () и в 5’-GUCU / 3’-UCUG. C пары UC в 5’-GUCC / 3’-CCUG демонстрирует резонансы амино h51, которые отличаются на ≥ 0,8 м.д. от резонансов аминокислот C h51 внутренней петли в 5’-GUCU / 3’-UCUG (). Аминохимические сдвиги цитозина в 5’-GUCC / 3’-CCUG ближе к таковым для 5’-UUCG / 3’-GCUU, где образуются стабильные пары UC (C7h51 составляет 6,52 частей на миллион и C19h51 составляет 6,61 частей на миллион, см. Таблицу S2). Кроме того, химические сдвиги U h2 ’, h3’ и H5 в 5’-GUCC / 3’-CCUG не очень хорошо сравниваются с химическими сдвигами, наблюдаемыми для 5’-GUCU / 3’-UCUG ().Дополнительный дуплекс (GUC,), (‘-GCAGUCUGCA) ₂, был разработан для измерения химических сдвигов пары UU, фланкированной парами GC, как постулируется для возможной структуры, показанной на. Сравнение химического сдвига между U в дуплексе GUC и U6 / U18 в дуплексе GUCU показало поразительное сходство (). Кроме того, спектр имино-протонов GUCU при -1 ° C показал небольшой пик при 10,36 м.д., эквивалентный сдвигу для U5 в GUC (рис. S7). Вместе эти модельные дуплексы указывают на высокую популяцию внутренней петли с парами GC, окружающими центральную пару U-U, например, с динамическими фланкирующими остатками U (U8 / U20 / U21), которые сбрасываются примерно в 40% случаев.

Таблица 2.

Сравнение химических сдвигов урацила между GUCU (/), GUC () и GUCC ().

Последовательность	Остаток	h2 ‘	h3′	h51	h52	H5	H6
		5,60	7,66
GUCU	C7	5.88	4,44	8,20	7,14	5,75	7,75
GUCU	C19	5,77	4,32	8,06	7,24	8,06	7,24

4,4 9029

Последовательность	Остаток	h2 ‘	h3′	h4	H5	H6
GUCC				4,915	7,551
GUCU	U6	5.454	4,027	(10,36) ^{^b}	5,12	7,489
GUCU	U18	5,397	4,166	(10,36) ^⁷	GUC	U5	5,384	4,143	10,39	5,122	7,426

GCCU Несамо-комплементарный дуплекс

показывает предполагаемую вторичную структуру несамостоятельного протона и 1D-самопротонный спектр -complementary-duplex, GCCU, содержащий внутренний цикл 5′-GCCU / 3′-UCCG.Как и в случае GCUU () и GUCU (), резонансы для ожидаемых пар Уотсона-Крика присутствуют, но пики имино NOE GU колебания не наблюдались в 2D-спектре (Рисунок S8).

Двумерные спектры ЯМР показывают, что дуплекс GCCU существует в равновесии между второстепенными самокомплементарными дуплексами и основным несамокомплементарным дуплексом (Рисунок S9). ⁷ Второстепенные дуплексные структуры нельзя титровать из раствора путем добавления разработанной несамокомплементарной нити (Рисунок S10).Эти второстепенные дуплексы составляют <15% от общей концентрации цепей, но усложняют анализ разработанной внутренней петли 2 × 2 нт, поскольку в спектрах 2D ЯМР присутствует большое количество пиков. Хотя процент второстепенных дуплексов невелик, их резонансы могут быть сопоставимы по объему NOE, поскольку они являются самокомплементарными дуплексами. Таким образом, их объемы NOE удваиваются по сравнению с объемами основного несамокомплементарного дуплекса. Эти второстепенные конформации и обширное перекрытие химического сдвига предотвращают отнесение многих из резонансов h2 ’в несамокомплементарном дуплексе GCCU (Таблица S5).Стабильность этих альтернативных конформаций была отмечена ранее, ⁷, причем обе имеют температуру плавления, аналогичную температуре плавления несамокомплементарного дуплекса.

Добавление 2 мМ MgCl

₂ к дуплексам GCUU, GUCU и GCCU не изменяет химические сдвиги иминопротонных резонансов.

Пары GU могут иногда связывать катионы. ^39–41 Чтобы увидеть, может ли Mg ²⁺ влиять на спаривание GU в дуплексах GCUU, GUCU и GCCU, были сняты 1D ЯМР-спектры в присутствии 2 мМ MgCl ₂ (Рисунки S1 – S3).Существенных изменений не обнаружено.

Прогнозирование трехмерной структуры с помощью ROSIE и сравнение с моделями, полученными методом ЯМР химических сдвигов.

²⁸ Для всех трех дуплексов предсказания самой низкой энергии, полученные на основе химических сдвигов, согласуются с неканоническими взаимодействиями основание-основание при моделировании отжига ().Для 5’-GCUU / 3’-UUCG даже суженная малая бороздка () была отражена в прогнозах с химическими сдвигами и без них. Для 5’-UUCG / 3’-GCUU предсказания показали узкую малую бороздку со всеми поперечными нитями петель расстояниями h2’-h2 ’между 5,0 и 6,0 Å. В этой области не было обнаружено кросс-цепочечных NOE h2’-h2 ’, что согласуется с предсказанием ограниченного сужения. Для дуплекса GCUU () структура с самой низкой энергией в отсутствие химических сдвигов показала необычное спаривание G5-U20, в котором имино-протоны G5 и U20 указывали прямо друг на друга (Рисунок S11).Добавление химических сдвигов сделало эту пару промежуточной между раздвоенной () и колебательной () парой.

Таблица 3.

Сравнение структур ЯМР и FARFAR для внутренних петель

Последовательность	Ограничения химических сдвигов?	RMSD контура ^{^a} (Å)
GCAU	N	0,940
GCAU	Y	0,934
		UUCG554
	Y	1.594
GCUU	N	1.731
GCUU	Y	1.676

Обсуждение 9 пар в структуре GU

часто встречаются в структуре GU наиболее распространенная пара оснований. ^42–44 GU пары настолько распространены, что их часто считают третьей канонической парой в РНК. Более конкретно, для внутренних петель 2 × 2 нт, по меньшей мере, одна пара GU фланкирует петлю приблизительно 25% времени.⁵ Термодинамическая стабильность комбинаций ближайших соседей с одной парой оснований GU подобна комбинациям ближайших соседей с одной парой AU. ⁴⁵ Однако, несмотря на кажущуюся термодинамическую стабильность при соседстве с парами Уотсона-Крика, внутренние петли 2 × 2 нт с мотивом (5′-GMNU) ₂ менее термодинамически стабильны, чем внутренние петли 2 × 2 нт категории 1 с мотив (5′-AMNU) ₂. ^{7, 15} Следовательно, трехмерные структуры внутренних петель (5’-GMNU) ₂ могут быть информативными о причинах дестабилизации этого класса внутренних петель.Исследуемые здесь дуплексы обнаруживают несколько схем спаривания без колебания для «пар» GU, фланкирующих внутренние петли размером 2 × 2 нт. Такие необычные структуры могут предоставить элементы распознавания для биологических функций и эталоны для методов тестирования для предсказаний de novo трехмерной структуры.

Внутренняя петля 5’-GCAU / 3’-UACG имеет пары GU вобуляции.

Дуплекс GCAU () содержит две пары CA, окруженные двумя парами GU вобуляции. NOE между G4h2 и U7h4 согласуется с парами GU, фланкирующими внутреннюю петлю, находящимися в конформации колебания.Однако сила сигнала / громкость пика U7h4 () предполагает, что на U7 может сильно повлиять обмен с водой. Измеренный параметр ближайшего соседа 3,7 ккал / моль для (5’-GCAU) ₂ аналогичен таковому для другой категории — внутренние петли 2 × 2 нт, фланкированные колебанием GU или парами AU. ^{3–5, 7} Внутренняя петля 5’-GCAU / 3’-UACG содержит пару пиримидин-пурин (), что может обеспечить большую стабильность, поскольку искажение основной цепи минимально.

Внутренняя петля 5’-UUCG / 3’-GCUU имеет пары GU колебания

Дуплекс UUCG также имеет боковые пары колебаний GU, замыкающие внутреннюю петлю 5’-UUCG / 3’-GCUU (и).Спектры 2D ЯМР имеют сильные кросс-пики имино-имино NOE для двух GU, фланкирующих внутреннюю петлю: U5h4-G20h2 и U17h4-G8h2 (). Это была единственная изучаемая здесь внутренняя петля с U пары GU 5 ’внутренней петли. В конце спиралей колебательный GU с этой ориентацией лучше взаимодействует с парами Уотсона-Крика, ^46,, что может способствовать взаимодействию с накоплением в колебательной конфигурации (рис. S12). База данных тандемных несовпадений из различных вторичных структур РНК содержит U пар GU 5 ’петли гораздо чаще, чем G 5’ петли.⁵ За исключением внутреннего контура 5′-UUCG / 3′-GCUU, который является наименее термодинамически благоприятным из всех контуров 5′-UMNG / 3′-GNMU, петли 5′-UMNG / 3′-GMNU являются более стабильны, чем петли 5′-GMNU / 3′-UNMG. ⁷ Исключение по сравнению с 5’-GUCU / 3’-UCUG связано с образованием GC, а не пар GU (). Очевидно, ориентация пар GU, фланкирующих внутренние петли, важна для термодинамики внутренней петли и может также быть важной для определения того, принимают ли фланкирующие GUs конформацию колебания.

Внутренняя петля 5’-GCUU / 3’-UUCG имеет раздвоенные пары GU

Дуплекс GCUU не показывает кросс-пики NOE, указывающие на образование колебания GU (). Моделирование внутренней петли 5’-GCUU / 3’-UUCG показало, что пары GU, фланкирующие внутреннюю петлю, образуют раздвоенную пару GU (и), сопровождаемую локальным сужением малой бороздки (). Это сужение явно наблюдалось в виде аномальных перекрестных цепей h2 ’к h2’ NOE (). h2′-h2 ‘NOE, в сочетании с G-амино к U h2’ NOE из потенциальной пары GU, и / или отсутствие идентифицируемого имино из U и / или G могут служить отличительным признаком ЯМР для идентификации подобных раздвоенных пар в других РНК.

Раздвоенные пары GU похожи на пары колебаний (, и). Основное различие между двумя типами пар оснований состоит в том, что в бифуркационной паре GU карбонил U O 2 разделен имино-аминогруппой G h2 и аминогруппой, тогда как колебание GU имеет одинарную водородную связь между карбонилом U O 2 и имино-протоном G h 2. . Кроме того, в бифуркационной паре водородная связь имино-протона U h4 / карбонила G O6 ослаблена или отсутствует. Среднее по ансамблю расстояние между U N3 (донор) и G O6 (акцептор) в этих парах составляло 4.4 Å, что не считается водородной связью. ³⁷ Анализ пар оснований с использованием DSSR ⁴⁷ показывает большой параметр раскрытия пары по сравнению с типичными колебаниями GU. Используя этот параметр большого раскрытия в качестве критерия структурного поиска в сочетании с RNA FRABASE, ⁴⁸ несколько других потенциальных разветвленных пар GU были идентифицированы в структурах кристалл / ЯМР. Таблица S10 перечисляет их вместе с соответствующими параметрами пары оснований. Данные кристаллов предполагают, что раздвоенные пары GU могут формироваться в контекстах, отличных от фланкирующих петель.

Хотя по структуре похожи на вобуляционные пары GU, раздвоенные пары GU имеют разные свойства. Раздвоенная пара закрепляет основания G и U с помощью H-связей в трех, а не в четырех местах, как с парами колебаний GU. Это, вероятно, приведет к дополнительной динамике в бифуркационной паре GU, что помогает объяснить отсутствие иминорезонанса, наблюдаемого для пары. Кроме того, наличие одной трехцентровой Н-связи вместо двух двухцентровых Н-связей, вероятно, повлияет на термодинамику спаривания. ⁴⁹ Пара также имеет разную ориентацию штабелирования из-за разной ориентации оснований G и U.В дополнение к сужению малой канавки, лицо распознавания для раздвоенной пары cWS GU внутри большой канавки изменяется относительно таковой для пары вобуляции. В разветвленной паре карбонил G и имино-водород не связаны водородными связями и отображаются внутри большой бороздки, обеспечивая уникальный интерфейс распознавания для взаимодействия с другими молекулами. Например, карбонильные и аминогруппы в боковых цепях Asn и Gln могут входить в большую бороздку такой раздвоенной пары GU.

Внутренняя петля 5’-GUCU / 3’-UCUG образует пары GC

Дуплекс GUCU продемонстрировал резкое отклонение от ожидаемых пар GU, поскольку были обнаружены доказательства двух пар GC, фланкирующих центральную пару U-U (). Измененная конфигурация внутренней петли напоминает основную структуру «внутренней петли» 5’-GAGU / 3’-UGAG, в которой U ожидаемых пар GU выходят из спирали. ^{38, 50} Это оставляет срезанные пары GG, фланкирующие центральную стопку A-A. Для того чтобы измененные конфигурации в 5’-GAGU / 3’-UGAG и 5’-GUCU / 3’-UCUG присутствовали в растворе, ожидаемая структура, содержащая пары GU колебания, должна быть относительно неблагоприятной.Внутренний контур GUCU кардинально отличается от 5’-UUCG / 3’-GCUU, который вместо этого содержит две пары колебаний GU в обратной ориентации. Эти два дуплекса являются еще одним примером важности ориентации пар GU, фланкирующих внутреннюю петлю.

Внутренняя петля 5′-GCCU / 3′-UCCG не имеет GC или колебательных пар GU

Спектры ЯМР (, S8–10) для внутренней петли 5′-GCCU / 3′-UCCG были особенно трудны для интерпретации из-за наличия небольшого количества самокомплементарных дуплексов в дополнение к предполагаемому несамокомплементарному дуплексу.Однако спектры показывают, что пары колебаний GU не образуются, как 5’-GUCU / 3’-UCUG и 5’-GCUU / 3’-UUCG.

Последовательность петли, 5′-GCCU / 3′-UCCG, потенциально может образовывать конформацию, аналогичную конформации 5′-GUCU / 3′-UCUG (), с центральной парой C6-C18, фланкированной G5. -C19 и G17-C7 пары GC. Хотя не удалось провести окончательную идентификацию для всех четырех остатков C во внутренней петле, окончательно был назначен A9H8. Есть некоторый объем NOE, соответствующий перевернутому U8, но подавляющее большинство объема, соответствующего A9H8, было связано с каноническим пиком U8h2’-A9H8.Очевидно, большая часть РНК находилась в ожидаемой вторичной структуре, а не в альтернативной конфигурации спаривания, такой как 5’-GUCU / 3’UCUG. Вероятно, это связано с тем, что одиночные пары U-U более стабильны, чем одиночные пары C-C. ^{51, 52}

GU-пары с U 5 ’внутренней петли обычно представляют собой пары колебаний.

GU-пары, окруженные парами Уотсона-Крика при выравнивании последовательностей, обычно образуют структуры колебания. ^{8, 9, 45} Однако при фланкировании внутренних петель они могут образовывать различные водородные связи ^{12, 14, 33, 38, 50} () и даже разные пары ().Такие неожиданные структуры могут предоставить элементы распознавания для функции РНК. Таким образом, важно разработать правила для прогнозирования склонности пар GU к образованию колебаний или необычных структур. Хотя база данных таких структур небольшая, ⁵³, она позволяет предлагать рабочие гипотезы для прогнозирования, когда пары GU в выровненных последовательностях будут или не будут образовывать пары колебаний, по крайней мере, для симметричных по длине внутренних петель. Обычно пары GU колебания образуются, когда последовательность имеет U пары GU 5 ’к петле.^{3, 35, 50, 54} Это может быть частично связано с тем, что ближайшие соседи 5′-wU / 3′-cG в среднем на 0,4 ккал / моль более стабильны при 37 ° C, чем 5′-wG / 3 ‘-cU ближайшие соседи, где wc представляет пару Ватсона-Крика. ⁴⁵

Пары GU с G 5 ‘внутренней петли могут образовывать пары без колебаний

Здесь три дуплекса без пар колебаний GU имеют G 5′ к внутренней петле и добавление Mg ²⁺ не повлиял на одномерные имино-протонные спектры (рис. S1–3).Все три из этих дуплексов также содержали пару AU, предшествующую паре GU. Предыдущие 1D ЯМР-спектры предоставляют четыре дополнительных примера пар GU в 5′-AG-внутренняя петля / 3′-UU-внутренняя петля или 5′-UG-внутренняя петля / 3′-AU-мотив внутренней петли, которые не дают GU колебания. ⁷ Во всех этих примерах есть ближайшие соседи 5’-AG / 3’-UU и / или 5’-UG / 3’-AU, которые являются наименее стабильными из ближайших соседей, содержащих GU рядом с парой Уотсона-Крика. ⁴⁵ В совокупности эти результаты предполагают, что последовательности в мотиве 5′-AG-внутренняя петля / 3′-UU-внутренняя петля или 5′-UG-внутренняя петля / 3′-AU-внутренняя петля могут не образовывать GU колебания.Кроме того, стоит отметить, что эти внутренние петли менее термодинамически стабильны, чем ожидалось из прогнозов. ⁷ Петли ориентации 5’G редко встречаются в известных вторичных структурах, возможно, из-за их неблагоприятной стабильности по сравнению с другими петлями. ⁵

В дуплексе была изучена особенно интересная внутренняя петля: 5’-GAGGAAGGCGA / 3’-PCUCUAAUUGCU, где P представляет собой пуриновый нуклеозид. ⁵⁵ Петля обнаружена в самосплайсинговых интронах группы I из Candida albicans и Candida dubliniensis .В этой петле GU с G 5 ’к петле (AA) ₂ не образует колеблющуюся пару, и ее аминогруппа, вероятно, участвует в стабилизирующей Н-связи (например, в паре в). Очевидно, что пара AU, предшествующая GU с G 5 ’к петле, не является существенной для образования пары без колебания. Другая пара ГУ, примыкающая к петле (AA) ₂, также не образует устойчивую пару колебаний, но является динамической. Третья пара GU имеет конформацию вобуляции. Неудивительно, что соседняя с ней пара ГУ не колеблется.При окружении парами Уотсона-Крика приращение свободной энергии ближайшего соседа 5’-GG / 3’-UU благоприятно всего на 0,25 ккал / моль при 37 ° C. ⁴⁵ По-видимому, петлю 5’-GAAGG / 3’-UAAUU можно рассматривать как петлю 3 × 3 н., Замкнутую двумя парами GU с разной ориентацией и структурой.

Значение для предсказания вторичной структуры РНК

В отсутствие спаривания GU вобуляции рядом с внутренними петлями, можно рассматривать пары GU без колебания как часть петель.Данные ЯМР и термодинамики, представленные здесь (), дают физическую причину для рассмотрения пар GU без колебания как части внутреннего контура. Для дуплексов, обсуждаемых здесь, многие внутренние петли, окруженные не колеблющимися парами GU, имеют термодинамическую стабильность при 37 ° C, более точно предсказываемую как внутреннюю петлю 4 × 4 нт текущими моделями ^{5, 56}, а не как 2 × 2 nt внутренний цикл (). Это неудивительно, поскольку современные модели используют параметры ближайшего соседа, измеренные для пар GU колебания.⁴⁵ Как и ожидалось, все изученные здесь петли, фланкированные парами GU колебания, более точно предсказываются как внутренние петли 2 × 2 нт. В настоящей работе наиболее резкое отсутствие спаривания GU вобуляций было обнаружено в дуплексе GUCU (). В этом случае значительная часть дуплексов образуют две пары GC и пару UU вместо двух пар GU и двух пар UC. Это сопровождалось переворотом двух (или, возможно, трех) U вне спирали вместо образования пар GU. Предположительно, две неожиданные пары GC позволяют формировать мотив 5’-GUC / 3’-CUG, который может иметь благоприятную свободную энергию между -0.5 и -1,8 ккал / моль в зависимости от расположения в дуплексе. ⁵¹ Родственный мотив был обнаружен для основной структуры внутренней петли 5’-GAGU / 3’-UGAG, где образуются две пары GG и две U-образные перевернутые. ³⁸ Очевидно, выпадение U и альтернативное спаривание G с петлевым нуклеотидом также следует учитывать при поиске потенциально необычных структур, более благоприятных, чем пары GU.

Таблица 4.

Приращения свободной энергии для внутренних контуров 2 × 2 нт вместе с тем, присутствуют ли обнаруженные ЯМР пары GU колебания.

Внутренний контур ⁷	2 × 2 Измеренное ΔG ° _³⁷ (ккал / моль) ⁷	2 × 2 Прогнозируемое ΔG ° _³⁷ (ккал / моль) ⁵	2 × 2 \| ΔΔG \| (ккал / моль)	4 × 4 Измеренное ΔG ° _³⁷ (ккал / моль) ⁷	4 × 4 Прогнозируемое ΔG ° _³⁷ (ккал / моль) ⁵⁶	4 × 4 \| ΔΔG \| (ккал / моль)	Колебание GU
5’-GCAU / 3’-UACG	3.6	3,0	0,6	0,0	2,2	2,2	Y
5′-UUCG / 3′-GCUU	4,3	3,0	1,3	2,8	Y
5′-GCUU / 3′-UUCG	5,4	3,0	2,4	4,6	3,6	1,0	N
U 3′-UUG 3′-UUG 3′-UUG	4,1	3,0	1.1	3,4	3,6	0,2	N
5′-GCCU / 3′-UCCG	5,1	3,0	2,1	4,4	3,6			5′-GAAU / 3′-UAAG	5,4	3,0	2,4	4,5	3,6	0,9	N ^a
5′-GACU / 3′-	3,6297	3,0	0,6	2.8	3,6	0,8	N ^{^a}

Точность прогнозирования 3D-структуры с помощью ROSIE

Точность прогнозирования структуры de novo с помощью алгоритма FARFAR ^{26, 29} была замечательной. Почти все неканонические взаимодействия были предсказаны низкоэнергетическими структурами для 5′-GCAU / 3′-UACG, 5′-UUCG / 3′-GCUU и 5′-GCUU / 3′-UUCG с ограничениями химического сдвига или без них. (). Введение химических сдвигов в прогнозы зафиксировало необычную пару G5-U20 в пределах 5’-GCUU / 3’-UUCG (рис. S11).Расчеты для дуплекса GUCU не предпринимались, поскольку химические сдвиги являются средними для более чем одной структуры.

Точность трехмерных прогнозов в области внутреннего контура предполагает, что использование прогнозов на основе химического сдвига может дополнительно подтвердить структуры, моделируемые с помощью полученных ЯМР ограничений расстояния и скручивания. Кроме того, точность прогнозов также указывает на то, что ограничения, основанные на химическом сдвиге, в дополнение к ограничениям расстояния / скручивания при моделировании, могут дополнительно помочь структурному определению с помощью ЯМР.Взвешенная комбинация ограничений расстояния от NOE, угловых данных от скалярной связи и / или RDC и химических сдвигов может помочь уточнению силового поля дать более точные 3D-модели.

Последствия для тестирования силовых полей

Оценка точности силовых полей РНК часто выполняется в основном с помощью шпилек. ^57–60 Стабильные шпильки, такие как UNCG или GNRA, исторически использовались для тестирования силовых полей РНК, потому что системы хорошо определены. Однако становится понятно, что многие РНК существуют как ансамбли структур.^61–63 Более того, структура и динамика РНК зависят от тонкой конкуренции между водородными связями, укладкой, гидратацией и электростатикой. ⁶⁰ Таким образом, сравнительный анализ силовых полей РНК требует множества различных типов систем. Обсуждаемые здесь дуплексы предоставляют несколько новых объектов для тестирования силовых полей. Например, дуплекс GUCU представляет собой особенно сложную систему для проверки того, могут ли силовые поля воспроизводить переворачивание U8, U20 и / или U21 при формировании пар G5-C19, G17-C7 и U6-U18 ().

Возможные последствия для биологической функции

Спектры ЯМР выявили две неожиданные схемы спаривания: (1) раздвоенные пары GU соединяются с узкой малой бороздкой в дуплексе GCUU (и), и (2) пары GC заменяют пары GU в дуплекс GUCU (). Оба обеспечивают потенциальные элементы распознавания для связывания с РНК. В то время как дуплексы, изученные здесь, имеют симметричные последовательности внутренних петель, вполне вероятно, что взаимодействия ближайших соседей управляют этими структурами. Таким образом, такие структуры следует рассматривать на каждом конце асимметричной петли, особенно когда потенциальная пара GU имеет G 5 ’петли.Одним из примеров является петля 5’-GGAAGG / 3’-CUAAUU из некоторых самосплайсинговых интронов группы I. ⁵⁵

GU10 ОСНОВНЫЕ ЛАМПОЧКИ, GU10, GU-10, GZ10, GZ-10, GU10 ЛАМПЫ, ЛАМПЫ GU10, ФОНАРИ GU10, ЛАМПЫ GU-10, ГАЛОГЕНЫ GU10, FMW / FG / GU10, EXN / FG / GU10, EXN / FG / 130V / GU10, BAB / FG / GU10, FMW / FG / 240V / GU10, EYC / FG / GU10, 50PAR20NFL / GU10, E26 К ПЕРЕХОДНИКУ GU10

FTH (35Вт / 120В) ОБЪЕКТИВ MR11 FLOOD GU10 BASE		СРЕДНИЙ (E26) ДЛЯ GU10 / GZ-10 ПЕРЕХОДНИК ДЛЯ БАЗОВОГО ФАРФОРА


FTH (20 Вт / 120 В) LENSED MR11 FLOOD GU10 BASE — 35 Вт, 120 вольт, 36 градусов, наводнение MR11 с крышкой GU10 Base, 2000 часов.		Средний (E26) к фарфоровому переходнику GU10 / GZ-10. Номинальная мощность 660 Вт и 250 В.

LED6.5MR16 / 50L / FL / 830 GU10 База		FMW / FG / GU10 (35W / 120V) Flood MR16 GU10 База


Светодиод 6.5MR16 / 50L / FL / 830 База GU10 — светодиодная лампа MR16 с регулируемой яркостью 6,5 Вт 3000K, цоколь GU10, 25000 часов		FMW / FG / GU10 (35 Вт / 120 В) FLOOD MR16 GU10 BASE — 35 Вт 120 В MR16 38 градусов Flood GU10 База с линзой, 2000 часов

EXN / FG / GU10 (50 Вт / 120 В) FLOOD MR16 GU10 BASE		FTD (20W / 120V) ОБЪЕКТИВ MR11 FLOOD GU10 BASE


EXN / FG / GU10 (50 Вт / 120 В) FLOOD MR16 GU10 BASE — 50 Вт 120 В MR16 38 градусов Flood GU10 База с линзой, 2000 часов		FTD (20 Вт / 120 В) LENSED MR11 FLOOD GU10 BASE — 20 Вт, 120 вольт, 36 градусов, наводка MR11 с крышкой GU10 Base, 2000 часов

BAB / GU10 (20 Вт / 120 В) FLOOD MR16 GU10 BASE		EXN / RED / GU10 (50 Вт / 120 В) Red Flood MR16 GU10 База


BAB / FG / GU10 (20 Вт / 120 В) FLOOD MR16 GU10 BASE — 20 Вт, 120 вольт MR16, 38 градусов, Flood GU10, база с линзой, 2000 часов		EXN / RED / GU10 (50 Вт / 120 В) Red Flood MR16 База GU10 — 50 Вт, 120 В, красный MR16, 38 градусов, Flood GU10 База с красной линзой, 2000 часов

EXN / BLUE / GU10 (50W / 120V) BLUE FLOOD MR16 GU10 БАЗА		EXN / GREEN / GU10 (50W / 120V) FLOOD MR16 GU10 BASE


EXN / BLUE / GU10 (50W / 120V) BLUE FLOOD MR16 GU10 BASE — 50 Вт, 120 вольт, синий MR16, 38 градусов, Flood GU10, база с красной линзой, 2000 часов		EXN / GREEN / GU10 (50W / 120V) GREEN FLOOD MR16 GU10 BASE — 50 Вт, 120 вольт, зеленый MR16, 38 градусов, Flood GU10, база с зеленой линзой, 2000 часов

EXN / ЖЕЛТЫЙ / GU10 (50W / 120V) FLOOD MR16 GU10 BASE		BAB / ЖЕЛТЫЙ / GU10 (20W / 120V) FLOOD MR16 GU10 BASE


EXN / YELLOW / GU10 (50W / 120V) YELLOW FLOOD MR16 БАЗА GU10 — 50 Вт, 120 В, желтый MR16, 38 градусов, Flood, GU10, база с желтой линзой, 2000 часов		BAB / YELLOW / GU10 (20W / 120V) FLOOD MR16 GU10 BASE — 20 Вт, 120 вольт, желтый MR16, 38 градусов, Flood GU10, база с линзой, 2000 часов

FMW / YELLOW / GU10 (35W / 120V) Yellow Flood MR16 GU10 База		FMW / GREEN / GU10 (35W / 120V) Green Flood MR16 GU10 База


FMW / YELLOW / GU10 (35W / 120V) YELLOW FLOOD MR16 GU10 BASE — 35 Вт, 120 Вольт MR16, 38 градусов, Flood GU10, база с желтой линзой, 2000 часов		FMW / GREEN / GU10 (35 Вт / 120 В) GREEN FLOOD MR16 GU10 BASE — 35 Вт 120 В MR16 38 градусов Flood GU10 База с зеленой линзой, 2000 часов

BAB / GREEN / GU10 (20 Вт / 120 В) FLOOD MR16 GU10 BASE


BAB / GREEN / GU10 (20W / 120V) FLOOD MR16 GU10 BASE — 20 Вт, 120 вольт, зеленый MR16, 38 градусов, Flood GU10, база с линзой, 2000 часов

Анализ встречаемости пар оснований G-U в 5S рРНК эукариот | Молекулярная биология и эволюция

Аннотация

Взаимосвязь структура-функция в молекулах РНК является ключом к пониманию выражения генетической информации.Различные типы РНК играют решающую роль почти на каждом этапе биосинтеза белка. В последние годы было показано, что одним из наиболее важных структурных элементов в РНК является пара вобуляции G-U. В этой статье мы впервые представляем анализ распределения пар G-U в 5S рибосомных РНК эукариот. Интересно, что пара GU у видов 5S рРНК преимущественно обнаруживается в двух внутриспиральных областях стеблей I и V и на стыке спирали IV и петли A. Распределение пар GU и природа соседних оснований предполагает их возможную роль в качестве основы сайт узнавания во взаимодействии с другими компонентами механизма биосинтеза белка.

Введение

В последние годы возник большой интерес к пониманию взаимосвязей структура-функция молекул РНК в клеточных процессах. Принято считать, что молекулы РНК, помимо их функций как носителей генетической информации и структурных каркасов для белков в различных рибонуклеопротеиновых комплексах, также обладают каталитической активностью (Bartel and Unrau 1999). Детальное понимание функции РНК требует точного знания правил, регулирующих формирование их структур более высокого порядка.

С самого начала изучения молекул РНК было известно, что сборка структур РНК более высокого порядка происходит не только за счет образования пар оснований Уотсона-Крика (AU и GC), но и за счет колебания пара (ГУ). Позже было обнаружено, что пару оснований G-U нельзя рассматривать просто как простую замену каноническим парам оснований. Различные структурные исследования РНК (ЯМР, дифракция рентгеновских лучей) показали, что пара оснований G-U вызывает некоторые искажения в спиральных областях РНК (White et al.1992; Wohnert et al. 1999). Это происходит из-за смещения остатка гуанина к малой бороздке спирали РНК относительно его местоположения в паре G-C, что приводит к значительной потере укладки 5 ‘гуанозина (Mizuno and Sundaralingam 1978). Следствием такой структуры является более низкая стабильность спирали (Freier et al. 1986), что дополнительно подтверждается наблюдением, что петли чаще всего возникают на 5’-стороне остатка гуанина пары оснований GU (Gautheret, Konings, и Gutell 1995).

Есть также несколько других примеров, которые предполагают, что распределение пар оснований GU в различных РНК не является полностью случайным и не определяется только структурными ограничениями: они составляют высокоспецифичные сайты узнавания для белков или других РНК (McClain et al. 1999; Рейес и др. 1999). В интронах группы I консервативная пара G-U в сайте сплайсинга участвует в образовании каталитического ядра, связываясь с другими частями молекулы (Reyes et al. 1999; Strobel and Cech 1995).Также было показано, что пара G ₃ -U ₇₀, расположенная в акцепторном стволе тРНК ^Ala из Escherichia coli , вносит значительный вклад в специфичность взаимодействия с родственной ей аминоацил-тРНК синтетазой (McClain et al. 1999; Хоу и Шиммель 1988).

До сих пор было очень мало известно о детальной функции рибосомных РНК (Correll et al. 1997). Первоначально они были признаны каркасом для рибосомных белков (Mueller et al.1995). Обнаружение каталитической активности некоторых РНК позволяет предположить, что они также могут принимать активное участие в процессе биосинтеза белка (Dai, De Mesmaeker, and Joyce 1995; Porse and Garrett 1999).

Недавно был опубликован расширенный анализ распределения G-U пар в больших рибосомных РНК с акцентом на их возможную функцию (Gautheret, Konings, and Gutell 1995). Самым маленьким компонентом РНК почти всех рибосом является 5S рибосомная РНК. Размер этой РНК в сочетании с доступностью относительно быстрых методов секвенирования РНК привел к накоплению большого количества данных, касающихся этой молекулы (Barciszewska, Erdmann, and Barciszewski, 1996).В этой статье мы анализируем распределение пары оснований G-U во вторичной структуре эукариотических 5S рРНК. Этот обширный анализ предоставляет некоторую новую информацию о возможных функциональных ролях пар G-U в 5S рРНК в отношении связывания белков и / или РНК, а также потенциальной каталитической функции.

Материалы и методы

нуклеотидных последовательностей 5S рРНК, проанализированных в этой статье, были взяты из наших банков данных (Szymański et al. 1997, 2000). Записи в базе данных используют формат банка данных нуклеотидных последовательностей EMBL.Записи нуклеотидов 5S рДНК содержат кодирующую последовательность 5S рРНК, а также информацию о длине исходного клона и местонахождении структурного гена.

Файлы с данными первичной структуры и выравниванием нуклеотидных последовательностей доступны в Интернете по адресу http://rose.man.poznan.pl/5Sdata/index.html. Любую нуклеотидную последовательность можно получить с помощью браузера таксономии или из алфавитного списка организмов (Szymański et al. 2000).

Нуклеотиды, встречающиеся во всех положениях в 285 эукариотических 5S рРНК, были приняты во внимание.Были рассчитаны частота и соотношение (%) найденных пар G-U.

Результаты и обсуждение

Предпосылкой для понимания взаимосвязи структура-функция в нуклеиновых кислотах являются данные об их первичной структуре. Принято считать, что более длинные цепи ДНК или РНК предоставляют гораздо более полные данные. Однако для больших молекул рибонуклеиновых кислот сложно выполнить подробный анализ особенностей вторичной структуры с использованием компьютерных методов или экспериментальных подходов (Barciszewska, Erdmann, and Barciszewski 1994; Szymański et al.1997). С другой стороны, виды малых РНК содержат очень мало информации, которая может быть полезна для филогенетического анализа, но они представляют собой очень хорошие модели для структурных исследований. 5S рибосомная РНК, несмотря на ее относительно небольшой размер 120 нуклеотидов и молекулярную массу 40 кДа, является одной из лучших молекул РНК, подлежащих изучению (Barciszewska, Erdmann, and Barciszewski, 1996). Более 30 лет исследований 5S рРНК привели к созданию нескольких моделей ее вторичной структуры. Однако очень мало известно о пространственной организации и элементах третичной структуры этой молекулы (Barciszewska, Erdmann, and Barciszewski 1996).

В этой статье мы проанализировали распределение пары оснований G-U в 285 последовательностях 5S рибосомных РНК, выделенных из эукариот (Szymański et al. 2000). Если учесть размер 5S рРНК, кажется, что эта молекула очень подходит для анализа влияния нестандартного спаривания оснований на структуру и функцию РНК. Сначала мы проанализировали сайты (позиции) вторичной структуры эукариотических 5S рРНК, в которых встречается пара G-U (рис. 1). Хотя пары G-U можно найти почти в каждом положении в двухцепочечных областях молекулы 5S рРНК, существуют некоторые сильные предпочтения в отношении локализации, а также ориентации в определенных сайтах (рис.1). Во вторичной структуре эукариотической 5S рРНК мы четко идентифицировали две области, занятые в основном парами оснований G-U. Один из них был расположен в стебле I, рядом с петлей A. Пары оснований G-U находились в положениях 7–112 и 8–111. Они присутствовали в 87% всех последовательностей 5S рРНК эукариот. Второй сайт был обнаружен в стволе V, где пара оснований G ₉₇ -U ₇₉ встречается в 81% эукариотических 5S рРНК. Из более ранних исследований известно, что влияние колебательной пары на общую структуру двухцепочечных областей РНК зависит от природы соседних пар оснований (Wohnert et al.1999). Кажется, что дестабилизирующий эффект пары G-U частично связан с потерей укладки 5 ‘остатка гуанина и может быть компенсирован присутствием пурина в этом положении (Gautheret, Konings, and Gutell 1995). Таким образом, мы разделили все сайты G-U, обнаруженные в 5S рРНК, на две группы: компенсированные (с пурином в положении 5 ‘G) и некомпенсированные (с пиримидином в положении 5’ G) (Gautheret, Konings, and Gutell, 1995). Как правило, наш анализ показал только две внутриспиральные позиции, в которых преобладает пара оснований G-U (таблица 1).Интересно, что более 70% нуклеотидных последовательностей 5S рРНК содержат нескомпенсированные пары G-U в одном или обоих из двух участков. Высокая частота встречаемости нескомпенсированных пар оснований G-U убедительно указывает на то, что этот мотив в структуре является реальной мишенью распознавания для взаимодействий 5S рРНК, например, с L5 или TFIIIA (Theunissen, Rudt, and Pieler 1998). Предварительный анализ эубактериальной 5S рРНК не подтвердил эту закономерность. Это разумно, потому что сеть взаимодействий прокариотической 5S рРНК отличается от ее эукариотического аналога (неопубликованные данные).

В стволе I наиболее консервативная пара G ₇ -U ₁₁₂ встречается почти исключительно в некомпенсированной конформации, но менее частая пара G ₈ -U ₁₁₁ всегда компенсируется. Однако существуют последовательности 5S рРНК, в которых отсутствуют пары оснований G-U; в некоторых случаях в этих регионах можно найти другую неканоническую пару, A-C. Мы думаем, что очевидное отсутствие консервативных пар G-U в некоторых молекулах 5S рРНК может быть результатом экспериментальных трудностей в различении остатков C и U с использованием современных процедур ферментативного секвенирования РНК (Barciszewska, Erdmann, and Barciszewski 1994).

Поразительно, но мы обнаружили очень сильное предпочтение паре вобуляции в стебле V. В 27% проанализированных пар 5S рРНК есть пара 5 ‘гуанозина G _{U ₉₆ -U ₈₀ 97} -U ₇₉ пара. Такое расположение очень консервативно и характерно для 5S рРНК многоклеточных животных. Интересно, что кристаллическая структура синтетических дуплексов РНК показала, что присутствие пары U-U вызывает некоторые изменения в общей геометрии двойной спирали (Baeyens, De Bondt, and Holbrook 1995).Есть также некоторые случаи в 5S рРНК, в которых пара G ₉₇ -U ₇₉ заменяется на U ₉₇ -U ₇₉ (Dallas and Moore 1997; Leonits and Westhof 1998). Когда эта позиция занята парой Ватсона-Крика, также может быть обнаружена другая пара колебаний, C ₉₆ -A ₈₀. Это особенно интересно в свете недавних исследований ЯМР 5S рРНК из E. coli. Анализ паттернов NOE, наблюдаемых для пар оснований G ₇₉ -U ₈₂ и A ₉₄ -C ₉₇, показал сходные дуплексные конформации для пар оснований G-U и A-C (Grüne et al.1996). Это наблюдение приводит к заключению, что пары оснований колебания играют важную роль в изменении структуры дуплекса РНК (Limmer et al. 1996; Rawlings, Matt, and Huber 1996). Изменение или искажение геометрии регулярной спирали может быть сайтом узнавания для другой РНК или белковой молекулы (Reyes et al. 1999). Существует всего несколько структур 5S рРНК, в которых стебель V состоит исключительно из пар оснований Уотсона-Крика, и наблюдаемое сохранение конфигурации колебания в этой области предполагает, что стебель V молекулы 5S рРНК может представлять собой сайт узнавания для белка или Связывание РНК (Wohnert et al.1999).

Помимо внутриспиральных пар G-U в стеблях I и V, есть еще два сайта на стыке спираль-петля, где они встречаются. Один из них расположен на конце стебля IV, рядом с петлей A, где консервативная пара G ₆₆ -U ₁₀₉ присутствует во всех последовательностях 5S рРНК эукариот. Похоже, что эта пара оснований играет решающую роль в формировании структуры высшего порядка петли A, которая служит шарнирной областью, где встречаются спирали I, II и IV (Limmer et al.1996; Theunissen, Rudt, and Pieler 1998). Анализ точечных мутантов в петле A показал, что эта область важна для распознавания 5S рРНК транскрипционным фактором IIIA (Theunissen, Rudt, and Pieler 1996; Rawlings, Matt, and Huber 1998). Еще одно место для часто встречающихся пар G-U — это соединение стебля I / петли A. Пара, образованная между G ₁₁₀ и U ₉, присутствует в 17% всех проанализированных нуклеотидных последовательностей 5S рРНК. В обоих случаях, когда пара G-U встречается в месте соединения спираль-петля, петля расположена на 5 ‘остатка гуанина, таким образом компенсируя потерю укладки, вызванную конформацией колебания.Подобные наблюдения были сделаны для пар G-U в больших рибосомных РНК (Gautheret, Konings, and Gutell 1995).

Влияние пары G-U на структуру спирали в стебле I 5S рРНК E. coli было изучено методом ЯМР-спектроскопии. Было показано, что общая геометрия спирали А-РНК искажена присутствием пары оснований G ₉ -U ₁₁₁ (G ₈ -U ₁₁₁ в эукариотической 5S рРНК) (White et al., 1992. ). Пара колебаний не складывается с предыдущей парой C ₈ -G ₁₁₂, но со следующей парой C ₁₀ -G ₁₁₀, которая закрывает шток I в месте соединения с петлей A.Было высказано предположение, что в таком расположении пара G-U отвечает за стабилизацию сложного соединения трех спиралей за счет стержня. В отличие от эубактерий, эта позиция, когда она занята парой G-U в 5S рРНК эукариот, находится в компенсированной конформации. Трудно сделать вывод, будет ли эффект такой договоренности таким же в случае некомпенсированной (Dallas and Moore 1997). ЯМР-исследование акцепторной ножки аланил-тРНК из E.coli показал, что присутствие пары оснований G ₃ -U ₇₀ вызывает неправильность спирали за счет смещения C ₇₁. Это приводит к уменьшению штабелирования между C ₇₁ и U ₇₀ (Лиммер и др., 1996).

До сих пор существовало только три пары G-U, которым приписывалась некоторая функциональная роль. Одна из них — это пара G ₃ -U ₇₀ в тРНК ^Ala, которая отвечает за распознавание аланил-тРНК синтетазой (Hou and Schimmel, 1988; McClain, Gabriel, and Schneider, 1996; McClain et al.1999), вторая — это пара GU в сайте сплайсинга интронов группы I (Strobel and Cech, 1995), а третья — это пара GU в пре-мРНК рибосомного белка L32 дрожжей, которая распознается белком L32 (белый и Ли 1996; Рейес и др. 1999). Следует заметить, что эти пары встречаются в разных структурных контекстах. В тРНК ^Ala искажение акцепторной ножки, вызванное парой GU, компенсируется остатком гуанина 5 ‘группы G. С другой стороны, консервативная пара GU в самосплайсинговых интронах всегда находится в некомпенсированной конформации (Strobel and Cech 1995).Конформация пары G-U в пре-мРНК L32 также не компенсируется (Strobel and Cech 1996). Можно предположить, что важность пары оснований G-U как детерминанты специфичности реакции аминоацилирования определяется ее специфическим распознаванием аминоацил-тРНК синтетазой. Это связано с наличием свободного экзоциклического амина остатка гуанина. Сходным образом, функциональные группы, присутствующие в малой бороздке в сайте сплайсинга интронов группы I, как предполагается, играют роль в формировании активного каталитического ядра рибозима (Strobel and Cech 1996).

Из приведенных выше наблюдений ясно, что пары оснований G-U вносят локальные искажения в геометрию регулярной спирали, которая может составлять сайты узнавания как для связывания РНК, так и для связывания с белками. По аналогии с ситуацией, наблюдаемой в интронах группы I, где пара GU участвует во взаимодействии с другими частями РНК, образующими каталитическое ядро (Strobel, Cech, 1995), можно предположить, что нескомпенсированные пары оснований GU в 5S рРНК связаны некоторыми фрагментами рибосомальной РНК.Однако существует лишь несколько известных примеров комплексов РНК-РНК, из которых можно сделать общие выводы. С другой стороны, есть доказательства того, что 5S рРНК может взаимодействовать с большой рибосомной РНК. Недавно было показано, что петля IV (петля E в 5S рРНК эукариот) эубактериальной 5S рРНК контактирует с доменами II и V 23S рРНК (Dokudovskaya et al. 1996).

Очевидно, что 5S рРНК, как часть большой нуклеопротеидной структуры, должна образовывать множественные контакты с другими ее компонентами.Более того, было показано, что 5S рРНК является частью сайта связывания фактора элонгации эукариот EF-2 (Nygard and Nilsson 1987). Неизвестно, играют ли рибосомные РНК каталитическую роль в биосинтезе белка. Трудно приписать конкретную функцию отдельным компонентам такого большого комплекса, как рибосома. Однако есть некоторые подсказки, указывающие на то, что РНК может принимать активное участие в этом процессе. Предложена модель ориентации 5S рРНК в 50S субъединице E.coli локализует стебель-петлю IV (стебель V, петля E) рядом с центром пептидилтрансферазы (Донцова и др., 1994). Интересно отметить, что в стволе IV 5S рРНК E. coli имеется пара G-U в положении, соответствующем консервативной паре G ₉₇ -U ₇₉ в 5S рРНК эукариот.

Таблица 1 Сводка основных внутриспиральных пар G-U в нуклеотидных последовательностях эукариотических 5S рРНК

Рис.1. — Распределение пары колебаний G-U (маленькие черные точки) во вторичной структуре эукариотической 5S рРНК. Участки, в которых пара G-U встречается с высокой частотой, отмечены прямоугольниками. Показаны только полностью консервативные нуклеотиды. Пара G ₆₆ -U ₁₀₉ (в коробке) сохранена на 100%. Пары оснований, отличные от G-U, отмечены линиями

Рис. 1. — Распределение пары колебаний G-U (маленькие черные точки) во вторичной структуре эукариотической 5S рРНК. Участки, в которых пара G-U встречается с высокой частотой, отмечены прямоугольниками.Показаны только полностью консервативные нуклеотиды. Пара G ₆₆ -U ₁₀₉ (в коробке) сохранена на 100%. Пары оснований, отличные от G-U, отмечены линиями

Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bundesministerium fur Forschung und Technologie, Fonds der Chemischen Industie E.V. и Польского комитета научных исследований.

цитированная литература

Байенс, К. Дж., Х. Л. Де Бондт и С.Р. Холбрук.

1995

. Структура двойной спирали РНК, включая пары оснований урацил-урацил во внутренней петле.

Struct. Биол.

–62.

Barciszewska, M. Z., V. A. Erdmann, J. Barciszewski.

1994

. Новый тип редактирования РНК.

транскриптов 5S рибосомальной ДНК редактируются для получения зрелой 5S РНК. Biochem. Мол. Биол. Int.

437

–448.

———.

1996

. Рибосомная 5S РНК: третичная структура и взаимодействия с белками.

Biol. Ред.

–25.

Bartel, D. P., and P. J. Unrau.

1999

. Построение мира РНК. Trends Biochem. Sci. 24 : M9 – M13.

Коррелл, К. К., Б. Фриборн, П. Б. Мур и Т. А. Стейтц.

1997

. Металлы, мотивы и узнавание в кристаллической структуре домена 5S рРНК. Ячейка 91 : 705–712.

Dai, X., A. De Mesmaeker, and G.F. Joyce.

1995

. Расщепление амидной связи рибозимом.Наука 267 : 237–240.

Даллас А. и П. Б. Мур.

1997

. Область D петли E 5S рРНК Escherichia coli: структура раствора обнаруживает необычную петлю, которая может быть важной для связывания рибосомных белков. Структура 5 : 1639–1653.

Докудовская С., Донцова О., Шпанченко О., Богданов А., Бримакомб Р.

1996

. Петля IV 5S рибосомной РНК имеет контакты как с доменом II, так и с доменом V 23S РНК. РНК 2 : 146–152.

Донцова О., В. Тишков, С. Докудовская, А. Богданов, Т. Деринг, Й. Ринке-Аппель, С. Тамм, Б. Грейер, Р. Бримакомб.

1994

. Стеблевая петля IV 5S рРНК расположена близко к пептидилтрансферазному центру. Proc. Natl. Акад. Sci. США 91 : 4125–4129.

Фрейер, С. М., Р. Кежек, М. Х. Карутерс, Т. Нейлсон и Д. Х. Тернер.

1986

. Вклад свободной энергии G-U и других терминальных несоответствий в стабильность спирали. Биохимия 25 : 3209–3213.

Gautheret, D., D. Konings, and R. Gutell.

1995

. Мотивы спаривания оснований G-U в рибосомной РНК. РНК 1 : 807–814.

Grüne, M., M. Görlach, V. Soskic, S. Klussmann, R. Bald, J. P. Fürste, V.A. Erdmann и L.R.Brown.

1996

. Первоначальный анализ спектров ЯМР 750 МГц селективно ¹⁵ N-G, U меченой 5S рРНК E.

coli. FEBS Lett.

385

114

–118.

Hou, Y. M., and P. Schimmel.

1988

.Простая структурная особенность является основным фактором, определяющим идентичность транспортной РНК. Природа 333 : 140–145.

Леонтис, Н. Б. и Э. Вестхоф.

1998

. Петля E 5S рРНК: химическое зондирование и филогенетические данные по сравнению с кристаллической структурой. РНК 4 : 1134–1153.

Лиммер С., Б. Рейф, Г. Отт, Л. Арнольд и М. Спринцл.

1996

. ЯМР свидетельствует о модификациях геометрии спирали парой оснований вобуляции G-U в акцепторном плече тРНК ^Ala E.

coli.FEBS Lett.

385

–20.

McClain, W.H., K. Gabriel, S. Bhattacharya, Y.-Y. Джоу и Дж. Шнайдер.

1999

. Функциональная компенсация за счет определенных нуклеотидных замен критической пары оснований колебания G * U во время аминоацилирования транспортной РНК.

J. Mol. Биол.

286

1025

–1032.

Макклейн, У. Х., К. Габриэль и Дж. Шнайдер.

1996

. Специфическая функция колебательной пары G-U из соседнего спирального сайта в тРНК ^Ala во время распознавания аланил-тРНК синтетазой.РНК 2 : 105–109.

Mizuno, H., and M. Sundaralingam.

1978

. Укладка пары колебаний Крика и пар Уотсона-Крика: правила стабильности пар G-U на концах спиральных стержней в тРНК и связь с взаимодействием колебания кодон-антикодон.

Nucleic Acids Res.

4451

–4461.

Ф. Мюллер, Т. Деринг, Т. Эрдемир, Б. Грейер, Н. Юнке, М. Оссвальд, Й. Ринке-Аппель, К. Стаде, С. Тамм и Р. Бримакомб.

1995

. Приближаемся к пониманию трехмерной структуры рибосомальной РНК.

Biochem. Cell Biol.

767

–773.

Nygard, O., and L. Nilsson.

1987

. Сайт связывания рибосом для фактора элонгации эукариот EF-2 содержит 5S рибосомную РНК. Биохим. Биофиз. Acta 908 : 46–53.

Порс Б. Т. и Р. А. Гарретт.

1999

. Механика рибосом, антибиотики и гидролиз GTP. Ячейка 97 : 423–426.

Rawlings, S. L., G. D. Matt, and P. W. Huber.

1996

.Анализ связывания фактора транскрипции Xenopus IIIA с 5S рРНК ооцита и геном 5S рРНК.

J. Biol. Chem.

271

869

–977.

Рейес, Дж. Л., Э. Х. Густафсон, Х. Р. Луо, М. Дж. Мур и М. М. Конарска.

1999

. С-концевой участок hPrp8 взаимодействует с консервативным динуклеотидом GU в 5′-сайте сплайсинга. РНК 5 : 167–179.

Strobel, S.A., and T.R. Чех.

1995

. Распознавание малых бороздок консервативной пары G-U в сайте реакции рибозима Tetrahymena.Наука 267 : 675–679.

———.

1996

. Экзоциклический амин консервативной пары G-U в сайте расщепления рибозима Tetrahymena способствует отбору 5′-сайта сплайсинга и стабилизации переходного состояния. Биохимия 35 : 1201–1211.

Шиманский М., М. Барцишевска, Я. Барцишевский и В. А. Эрдманн.

2000

. База данных 5S рибосомных РНК Y2K.

Nucleic Acids Res.

166

–167.

Шиманский, М., M. Z. Barciszewska, J. Barciszewski, T. Specht, V. A. Erdmann.

1997

. Компиляция нуклеотидных последовательностей 5S рибонуклеиновой кислоты рибосом: 5S рРНК эукариот. Биохим. Биофиз. Acta 1350 : 75–79.

Theunissen, O., F. Rudt, and T. Pieler.

1998

. Структурные детерминанты в 5S РНК и TFIIIA для образования 7S РНП.

евро. J. Biochem.

258

758

–767.

ван Книппенберг, П. Х., Л. Дж. Форменой и Х. А. Хеус.

1990

. Есть ли особая функция у пар оснований U-G в рибосомной РНК? Биохим. Биофиз. Acta 1050 : 14–17.

Уайт, С. А., М. Нильгес, А. Хуанг, А. Т. Брюнгер и П. Б. Мур.

1992

. ЯМР-анализ спирали I 5S РНК Escherichia coli. Биохимия 31 : 1610–1621.

Уайт, С. А. и Х. Ли.

1996

. Рибосомный белок L32 дрожжей распознает наложение РНК G: U. РНК 2 : 226–234.

Wohnert, J., A. J. Dingley, M. Stold, M. Gorlach, S. Grzesiek и L. R. Brown.

1999

. Прямая идентификация водородных связей NH… N в неканонических парах оснований РНК с помощью ЯМР-спектроскопии.

Nucleic Acids Res.

3104

–3110.

Базовые светодиоды GU24 — Светодиодные лампы

(2 результата)

База GU24: Что это такое?

Лампа GU24 включает в себя двухконтактный разъем для светодиодных и компактных люминесцентных ламп, который работает как байонетное крепление, которое устанавливается в совместимый светильник.Использование функции поворота и фиксации для фиксации лампы в патроне прямо контрастирует со стандартной винтовой базой в стиле Эдисона, которая используется в большинстве традиционных ламп. Вы не можете использовать базовую лампу GU24 в стандартной цоколе с винтовым креплением по (как я надеюсь) очевидным причинам.

Несколько преимуществ использования ламп GU24 по сравнению с традиционными лампами с винтовым цоколем, учитывая, что у вас есть совместимый светильник, во многом связаны с технологией, присущей самим лампам:

Самобалластные
Базовые лампы GU24 потребляют меньше энергии и имеют более длительный срок службы, чем традиционные аналоги
Они были разработаны, чтобы дать визуальную подсказку, представляющую базовую лампу GU24 как энергоэффективную лампу по сравнению со стандартной лампой
В некоторых штатах требуется, чтобы новая конструкция была оснащена патронами GU24 для предотвращения использования неэффективных и энергоемких ламп накаливания.

Некоторые примеры форм ламп, в которых используются цоколи GU24, включают A19, R30, BR40, PAR38, PL, модули Downlight и спиральные или поворотные лампы CFL, и GoodBulb — ваш лучший источник для всех! Позвоните, напишите по электронной почте или поговорите с одним из наших специалистов по освещению сегодня, чтобы найти идеальную лампу GU24 для любого проекта, большого или маленького.

База GU24: Что это такое?

Лампа GU24 включает в себя двухконтактный разъем для светодиодных и компактных люминесцентных ламп, который работает как байонетное крепление, которое устанавливается в совместимый светильник. Использование функции поворота и фиксации для фиксации лампы в патроне прямо контрастирует со стандартной винтовой базой в стиле Эдисона, которая используется в большинстве традиционных ламп. Вы не можете использовать базовую лампу GU24 в стандартной цоколе с винтовым креплением по (как я надеюсь) очевидным причинам.

Самобалластные
Базовые лампы GU24 потребляют меньше энергии и имеют более длительный срок службы, чем традиционные аналоги
Они были разработаны, чтобы дать визуальную подсказку, представляющую базовую лампу GU24 как энергоэффективную лампу по сравнению со стандартной лампой
В некоторых штатах требуется, чтобы новая конструкция была оснащена патронами GU24 для предотвращения использования неэффективных и энергоемких ламп накаливания.

Характеристика пары оснований GU Trans Watson-Crick, расположенной в каталитическом ядре антигеномного рибозима HDV

Образец цитирования: Lévesque D, Reymond C, Perreault J-P (2012) Характеристика Trans Watson-Crick Пара оснований GU расположена в каталитическом ядре антигеномного рибозима HDV. PLoS ONE 7 (6): e40309. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040309

Редактор: Джон Дж. Росси, Исследовательский институт Бекмана города Надежды, США of America

Поступила: 15.05.2012; Одобрена: 4 июня 2012 г .; Опубликован: 29 июня 2012 г.

Авторские права: © 2012 Lévesque et al.Это статья в открытом доступе распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указаны оригинальный автор и источник.

Финансирование: Работа поддержана грантом Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR; номер гранта MOP-44022) в JPP. JPP возглавляет Канадские кафедры геномики и каталитических РНК, и является членом Centre de Recherche Clinique Этьена Лебеля.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решений. опубликовать или подготовить рукопись.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что нет конкурирующих интересов существовать.

Введение

Понимание взаимосвязи структуры и функции РНК критически важно для дальнейшего развития в области молекулярной и клеточной биологии. Среди процессов, лежащих в основе функции РНК, сворачивание РНК является наиболее важным. и самое сложное.Кроме того, изучение сворачивания РНК имеет первостепенное значение. для улучшения наших знаний и понимания заболеваний, связанных с РНК, которые в свою очередь окажет серьезное влияние на здоровье человека. Рибозимы (Rz) являются интересные и удобные молекулы для изучения структуры / функции РНК отношения, потому что даже малейшее изменение в рибозиме структура обычно влияет на его каталитические свойства. Среди рибозимов Rz вируса гепатита дельта (HDV) был, пожалуй, наиболее изученным [1].Преобразование самоотщепляющейся нити HDV от cis — действующей на trans — действующей система за счет разделения Rz и субстрата (S) доменов значительно облегчила его исследование (рис. 1А). Как анализ структуры / функции, так и структурные исследования помогли выяснить его вторичная структура с двойным псевдоузлом, структура, состоящая из два стебля (стебли I и II, последний образует псевдоузел в cis -действующем вариант), две стебель-петли (III и IV) и три однонитевых соединения (I / II, I / IV и IV / II) (Рисунок 1А) [2].И соединение I / IV, и петля III на начальных этапах являются одноцепочечными. складчатости, но впоследствии вовлекаются в формирование псевдоузла. I.I [3].

Рисунок 1. Структура и путь сворачивания антигеномного HDV Rz.

( A ) Нуклеотидная последовательность и вторичная структура HDV Rz-антигеномная версия, использованная в этом исследовании. Рибозим и субстрат обозначаются Rz и S соответственно. Сайт расщепления обозначен значком стрела. Гармонизированная номенклатура с использованием римских цифр и цветов для стебли обозначены [2].Пунктирная линия представляет собой соединение I / II, которое было удалено для создания транс — действующая версия. На вставке показаны участвующие водородные связи. в формировании либо trans Watson-Crick / Hoogsteen, в конформации anti или trans Watson-Crick, в конформации syn , пара оснований GU между U ₂₃ и G ₂₈ петли III. Нумерация атомов для обоих нуклеотидных оснований Показано. Предполагаемый сайт связывания магния [21] также показан.( B ) Схематическое изображение вторичного структура мутантов, способных останавливать путь сворачивания HDV Rz на нескольких стабильных промежуточных соединениях. Указаны мутировавшие нуклеотиды.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040309.g001

Создание определенного набора мутантов, способных останавливать сворачивание. путь к нескольким стабильным промежуточным продуктам позволил провести дальнейшую характеристику пути складывания (рис. 1Б). Вкратце, распознавание S со стороны Rz приводит к образованию стебля I.Затем пять последовательных конформационных стадий производят каталитически активная структура. Первым из этих шагов является стыковка стержня I с каталитический сердечник, который объединяет среднюю часть стержня I с как остатки C ₂₂, так и U ₂₃ петли III [4]. Второй — формирование псевдоузла I.I, ключевого шага для упаковки спиралей [5]. Третий — образование A-минорного мотива между двумя аденозинами соединение IV / II и малая бороздка стержня III [6]. Наконец, четвертый и пятый этапы — соответственно формирование переключатель пары оснований (bp-switch), который расслабляет фосфодиэфирный остов переход IV / II и позиционирует каталитически активную C ₇₆ глубоко внутри каталитического ядра, а поворотный трилистник вращается вокруг экструдированного U ₇₇ [7] — [9].Переключатель bp, который встречается только в антигеномной версии, заменяет C ₁₉ -G ₈₁ bp для нового C ₁₉ -G ₈₀ bp в нижней части стержня II. Только затем вступает в действие каталитически активный C ₇₆. Кинетический было показано, что на этом пути сворачивания возникают ловушки; однако любые молекулы попавшие в кинетическую ловушку могут быть реинтегрированы в путь сворачивания [4].

Было показано, что ионы двухвалентных металлов необходимы для правильного катализа HDV Rz. при физиологическом pH [10].Несколько исследований предоставили указания на грубую локализацию Катионы Mg ²⁺, но без указания их точного положения. В частности, один находится между стволами I и III, другой движется по переход IV / II, а третий взаимодействует с расположенным рядом GU Wobble bp. к ножницеобразной связке [11].

Даже если описание пути сворачивания антигеномного HDV Rz это, безусловно, самый сложный путь сворачивания, выясненный на сегодняшний день для небольшого рибозим, вероятно, еще предстоит обнаружить другие важные шаги.Один из критических шагов, который еще предстоит выяснить, — это формирование необычный trans Watson-Crick ( t WW) (также известное как обратное колебание) пара оснований GU, обнаруженная в петле III. В антигеномном HDV Rz, эта пара оснований образуется путем образования двух Н-связей между O6 и N1H G ₂₈ с N3H и O4 U ₂₃, соответственно (Рисунок 1А, вставка) [12]. Это т WW Пара оснований GU высококонсервативна как в геномном, так и в антигеномном Rz [1], в HDV-подобном последовательности, обнаруженные в цитоплазматическом элементе полиаденилирования млекопитающих связывающий белок 3 (CPEB3) и гены, подобные CPEB3 [13], [14], а также в HDV-подобных последовательностях, обнаруженных как в семействах ретротранспозонов R2, так и L1Tc [15], [16].Абсолютный потребность в этих двух нуклеотидах иллюстрируется тем фактом, что биоинформатический поиск предполагаемых HDV-подобных мотивов во всех царствах жизни был основан на наличие шести инвариантных нуклеотидов, обнаруженных как в HDV, так и в человеческом CPEB3 Rz, и что два вышеупомянутых остатка были включены в число 6 инвариантных единицы [17]. Более того, беспристрастный эксперимент по селекции in vitro , в котором 25 нуклеотидов, включая все положения петли III антигеномной HDV Rz были рандомизированы и предоставили дополнительные доказательства важности остатки U ₂₃ и G ₂₈, поскольку они были почти идеально консервативны среди 330 секвенированных клонов [18].Взятые вместе, эти данные демонстрируют абсолютную потребность в наличии этих двух нуклеотидов внутри петли III для целостности HDV Rz.

ЯМР-эксперимент с использованием РНК продукта расщепления, основанный на геномной / антигеномной химерный HDV Rz показал, что U ₂₀ и G ₂₅ (которые соответствуют к U ₂₃ и G ₂₈ в антигеномной версии) петли III образуют базовую пару ГУ т WW [19]. С другой стороны, кристаллографические данные от продукта расщепления РНК, полученного из геномного HDV Rz выявили, что U ₂₀ и G ₂₅ граничат друг с другом. другой в ориентации t WW без образования водородных связей (см. PDB 1DRZ) [6].Более того, в этом кристалле G ₂₅ применяет более компактный и необычный полная конформация syn . Формирование этого т WW пара оснований не наблюдалась с использованием предварительно расщепленного комплекса, который был создан заменяет C ₇₅ (т.е. соответствует C ₇₆ антигеномного Rz) с уридином, но вместо этого образуется транс Пара оснований Уотсона-Крика / Хугстина ( t WH) (путем образования Н-связи между O6 G ₂₅ с N3H U ₂₀) с G в более обычной конфигурации anti был обнаружен (см. PDB 1SJ3 и рисунок 1A вставка) [7].Следовательно, было предложено, чтобы эта базовая пара т WW GU вероятно, образуется после химической стадии. Однако кристаллический анализ trans -действующего геномный / антигеномный химерный рибозим, в котором только U _-1 из субстрат был заменен дезоксиуридином (в результате нерасщепляемой подложки) продемонстрировали, что U ₂₀ и G ₂₅ взаимодействуют вместе до расщепления в транс Watson-Crick конфигурация с G в конфигурации syn (см. PDB 3НКБ и рис. 1А врезка) [20].Следовательно, кажется, что эти базы могут соединяться, образуя либо транс Пара оснований Уотсона-Крика / Хугстина с G в конформации анти , или базовая пара trans Watson-Crick с G в syn конформация. Более того, было показано, что эта пара оснований, вероятно, действует как карман для связывания магния, в котором двухвалентный ион нейтрализует отрицательные заряжает рядом с ГУ т WW, тем самым помогая переложить ПК _на каталитического C ₇₅ [21].

Наконец, молекулярно-динамическое (МД) моделирование привело к предположению, что этот магний, вероятно, будет хелатирован и способствует катализу [22]. Это Примечательно, что все эти результаты получены либо из кристаллов / ЯМР анализы, или моделирование МД, пока нет прямых доказательств о t WW Формирование пары оснований GU было продемонстрировано в растворе. Чтобы уточнить неточность относительно того, когда именно базовая пара t WW GU форм петли III, а также для подтверждения в растворе ее решающей роли в катализ HDV Rz, несколько экспериментов, направленных на определение характеристик его формирование в составе антигеномного Rz HDV.

Результаты

Кинетический анализ всех возможных

Trans Watson-Crick GU Mutants

Все 508 вариантов естественного HDV как с геномной, так и с антигеномной полярностью содержат остатки U ₂₃ и G ₂₈ в петле III [23]. Кроме того, несколько исследования структуры / функции, включая удаление и мутацию эти нуклеотиды показали, что они имеют решающее значение для рибозима каталитическая активность (например, [24] — [26]). Однако, Насколько нам известно, нет сообщений об исследовании мутаций, в котором оба остатка были одновременно мутированы.Чтобы выяснить, есть ли альтернатива базовый состав возможен для этих двух положений, мутантные рибозимы, кодирующие были синтезированы все 16 возможных комбинаций основание / основание. Стратегия, основанная по производству 16 различных ДНК-олигонуклеотидных матриц, заполненных методом ПЦР, каждый из них содержит промотор РНК-полимеразы Т7 и специфические уникальные нуклеотиды в положениях 23 и 28, и их последующее использование для транскрипции использовали специфические транс -действующие рибозимы. После производства эти рибозимы использовали в реакциях расщепления в условиях однократного оборота. которые включали следовые количества 5′-конца ³² P-меченного 11-нуклеотида субстрат (S) и 100 нМ рибозима ([Rz] >> [S]).Реакции инкубировали 2 ч при 37 ° C в присутствии 10 мМ MgCl ₂, а продукты реакции анализировали денатурирующим полиакриламидом. гель-электрофорез (PAGE) (см. рисунок 2А). В то время как исходный рибозим, который включал U ₂₃ и G ₂₈ показал уровень расщепления около 95%, изостерическое обратное колебание мутант, содержащий инвертированные нуклеотиды (т.е. G ₂₃ и U ₂₈) оказался неактивным (активность расщепления <2%). Этот результат демонстрирует что как идентичность нуклеотидов, так и пространственное окружение (например,г. а транс Возможное взаимодействие Watson-Crick или trans Watson-Crick / Hoogsteen) более важны, чем простое удержание изостерического обратного колебания базовая пара. Четыре из мутировавших рибозимов показали большую активность расщепления. более 15% (рис. 2А, Б). В частности, мутанты, включая G ₂₃ / G ₂₈, C ₂₃ / A ₂₈, U ₂₃ / A ₂₈ и U ₂₃ / U ₂₈ выставлены уровни расщепления, достигшие через 2 часа 16%, 40%, 17% и 44% соответственно, и оценены максимальные конечные уровни расщепления составлять 53%, 84%, 75% и 65% соответственно (данные не показаны).Эти результаты показывают, что эти четыре мутанта сохраняют некоторое расщепление. деятельности, хотя может потребоваться более длительное время инкубации, чтобы достигают значимой конечной точки по сравнению с Rz дикого типа. Среди эта группа активных рибозимов, C ₂₃ / A ₂₈ является единственной двойной мутант. Комбинация C ₂₃ / A ₂₈ имеет возможность для формирования пары оснований обратного колебания, как в случае U ₂₃ / G ₂₈ [27]. Однако, изостерическая комбинация A ₂₃ / C ₂₈, как и в случае G ₂₃ / U ₂₈, был признан неактивным, что подтверждает идею о важности как идентичности нуклеотидов, так и пространственного окружения.Важно отметить, что все активные рибозимы имеют пары оснований, которые могут образовывать не менее двух водородных связей в конфигурации т WW (рис. 2С). Расстояния между C1 остатки рибозы обоих нуклеотидов различаются незначительно, в пределах 11,1 Å. и 13,4 Å, и аналогичны оригиналу t WW U ₂₃ / G ₂₈ расстояние пары оснований 11,9 Å. Более того, без сомнения понятие пространственной ориентации, которое должно быть адекватным для правильного позиционирования химических групп, участвующих в связывании и координации Mg ²⁺ катион.Эти конкретные требования могут также объяснить различные виды деятельности. наблюдается для этих мутантов. Из одиннадцати других комбинаций, которые были найдены быть неактивным, пять могут быть объяснены либо недостаточным расстоянием, либо пространственным среды. Из оставшихся шести комбинаций две являются базовыми. которые не принадлежат к семейству trans Watson-Crick, и четыре связаны с неактивным мутантом U ₂₃ A (данные не показаны). Важно отметить, что эти результаты демонстрируют, что можно изменить идентичность остатки, расположенные в положениях 23 и 28, хотя эти модификации поразительно влияют на уровень расщепления.Примечательно, что т WH U ₂₃ / G ₂₈ пара оснований, в которой G оказался в конформации анти , был получен в предварительно расщепленном геномном кристалле Rz HDV [7]. В таком случае это могло быть возможно что активные базовые комбинации также должны иметь возможность принимать эту конкретную базу парное взаимодействие. Из шестнадцати базовых комбинаций шесть подходят не принадлежит к семейству trans Watson-Crick / Hoogsteen и два связаны с неактивным мутантом U ₂₃ A.Среди восьми других возможностей пять — активные базовые комбинации. Остальные три оставшихся могут быть удаленным по первым критериям относительно базы т WW пара. Взятые вместе, активные комбинации нуклеотидов, вероятно, должны иметь возможность взаимодействия либо в транс Взаимодействие Уотсона-Крика / Хугстина или trans Взаимодействие Уотсона-Крика манера.

Рисунок 2. Активность расщепления всех рибозимов, мутировавших в положениях 23 и 28.

( A ) Авторадиограмма денатурирующего геля для ПААГ используется для анализа реакций расщепления. Во всех случаях рибозимы (100 нМ) инкубировали в течение 2 ч со следовыми количествами меченного на 5′-конце субстрат (<1 нМ). Позиции красителя бромфенолового синего (БПБ), Показаны 11-нуклеотидный субстрат (S) и 4-нуклеотидный продукт (P). «Нег» представляет собой реакцию расщепления, проводимую в отсутствие Rz. ( B ) Графическое представление процентов расщепления для всех 16 нуклеотидов комбинации рассмотрены.Значения являются средними по крайней мере 2 различных экспериментов. а столбики ошибок представляют стандартное отклонение ( C ). Представление Н-связи и сайт связывания иона магния дикого типа (U ₂₃ / G ₂₈) и четыре других комбинации нуклеотидов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040309.g002

Чтобы дополнительно охарактеризовать важность баз, расположенных по адресу: обе позиции, кинетический анализ псевдопервого порядка пяти активных рибозимов (я.е. исходный рибозим и четыре мутанта). К ₂ и K _{M ’} представлены в таблице. 1. Рибозим дикого типа, который включает комбинацию U ₂₃ / G ₂₈ имел значение k ₂ 1,74 мин ⁻¹, что совсем другое от 0,19 мин ⁻¹, о которых сообщалось ранее [28]. Эта разница могла быть объясняется использованием субстрата, содержащего оптимальные значения от −4 до −1 последовательность нуклеотидов (т.е. 5′-C _-4 UAA _-1) [29], которая В предыдущей работе (т.е. 5′-G ₋₄ GGC ₋₁) [28]. Модель K _{M ’} значение, полученное с этим оптимальным субстратом (38,1 нМ), также значительно отличалось из наблюдавшегося ранее (9,1 нМ) [28]. Когда значение k ₂ рибозима дикого типа (например, U ₂₃ / G ₂₈) сравнивали с рибозимами, мутировавшими в положениях 23 и 28, наблюдались различия от 232 до 528 раз (см. Таблицу 1). Эти различия могут объяснить, почему эти мутанты в природе не обнаружены.И наоборот, K _{M ’} значения были практически идентичны, изменяясь только примерно в +/- 3 раза. (см. Таблицу 1). Четко, важное изменение значений k ₂ является основным объяснением за резкое снижение каталитической активности этих мутантов.

Наконец, было предложено, чтобы эта базовая пара т WW GU может играть центральную роль в координации иона магния, должным образом позиционируя его и приводя к катализу [22]. Чтобы проверить, находятся ли нуклеотиды в положениях 23 и 28 влияют на связывание этого иона металла, K _Mg значения были определены для каждого из активных мутировавших рибозимов и были по сравнению с исходным рибозимом с U ₂₃ / G ₂₈ комбинация нуклеотидов (Таблица 1).Этот последний рибозим имеет оценочное значение K _Mg, равное 4,4. мМ, что практически идентично таковым у мутантов с U ₂₃ / U ₂₈ и комбинации нуклеотидов C ₂₃ / A ₂₈ (т.е. 5,9 мМ и 6,1 мМ соответственно; см. таблицу 1). Это предполагает, что эти три рибозима связывают Mg ²⁺ с эквивалентным сродством. И наоборот, мутанты с комбинациями нуклеотидов G ₂₃ / G ₂₈ и U ₂₃ / A ₂₈ выставлены активности расщепления со значениями K _Mg, которые увеличивались в среднем из 2.5-кратное (т.е. 10,0 мМ и 12,3 мМ соответственно; см. Таблицу 1). Это не очень важно разница; однако это может указывать на другую зависимость от Mg ²⁺.

Таким образом, эти результаты показали, что пара оснований петли III может быть мутировал, но что замещенные основания должны иметь способность взаимодействовать и сформировать необходимую базу т. WH или т. WW. пара. Лучшая комбинация, с точки зрения активности расщепления, — это исходная Базовая пара ГУ.Кроме того, варьируя базовый состав на этих позициях вероятно, влияют на связывание магния, взаимодействующего с некоторыми функциональных групп пары оснований U ₂₃ / G ₂₈, или функционально необходимое сродство Mg ²⁺ к другому магнию сайт привязки.

Характеристика функциональных групп в пределах

Trans Watson-Crick или Trans Watson-Crick / Hoogsteen GU Base Пара
Образование двух Н-связей пары оснований GU t WW включает четыре разные функциональные группы (рис. 3А).В частности, группы O6 и N1H G ₂₈ взаимодействуют с группами N3H и O4 из U ₂₃ соответственно. Примечательно что в геномном Rz пара оснований t WH, образованная Н-связью между O6 G ₂₅ с N3H U ₂₀, было обнаружено в предварительно расщепленном геномном Rz [7]. Кроме того, в случае базовой пары t WW GU в петле III, было высказано предположение, что предполагаемый гидратированный Mg ²⁺ связывание ионов, вероятно, стабилизируется взаимодействиями Н-связи как с N7, так и с O6 группы ребра Хугстина остатка G ₂₈, а также с группой O2 из U ₂₃ [21].Чтобы узнать больше об участии некоторых из этих функциональных групп, смешанные олигонуклеотиды РНК-ДНК (RD), в которых разные химические группы были отсутствуют, были синтезированы. Эта стратегия смешанных олигонуклеотидов RD была ранее используется для изучения важных 2′-гидроксильных групп (2′-OH) антигеномного HDV Rz [28]. В основном стратегия включает замену рибонуклеотидных остатков. обоих стволов II и IV дезоксирибонуклеотидами, тем самым уменьшая синтез стоит без значительного изменения кинетических констант рибозима (см. рисунок 3B).Нашим знания, нет фосфорамидита, обладающего химическими заменами на уридине расположенный в позиции 23, который может быть использован в этом исследовании, коммерчески доступен. Следовательно, наши усилия были сосредоточены на химии, доступной для гуанозин, расположенный в позиции 28 (см. рисунок 3А). В частности, были использованы три химически разных вида: я. инозин (I), в котором группа NH ₂ связана с C2 гуанина удален; II. 2-аминопурин (2AP), в котором группа O6 гуанина, который, по-видимому, является акцептором Н-связи, участвующей в образовании trans -Watson-Crick пара оснований, удаляется; и, iii.7-деазагуанин (N7D), в котором N7 из гуанин заменяется углеродным остатком. Эта последняя модификация не влияют на спаривание оснований между U ₂₃ и G ₂₈, а скорее связывание предполагаемого вложенного иона Mg ²⁺.
Рисунок 3. Активность расщепления различных модифицированных химических групп G ₂₈.
( A ) Схематическое изображение trans -Watson-Crick Базовая пара GU (вставка) и три возможных замены для G ₂₈.( B ) Последовательность и вторичная структура исходного RD смешана. рибозим. Области в рамке представляют части ДНК олигонуклеотида. ( C ) Авторадиограмма денатурирующего геля для ПААГ, используемого для анализа реакций расщепления смешанных олигонуклеотидов RD, содержащих модифицированные химические группы. В каждом случае рибозим (100 нМ) инкубировали в течение 2 ч со следовыми количествами субстрата, меченного на 5′-конце (<1 нМ) и реакции анализировали на денатурирующих 20% -ных гелях для ПААГ.Neg представляет реакция расщепления, проводимая в отсутствие Rz. Позиции краситель бромфеноловый синий (BPB), 11-нуклеотидный субстрат (S) и 4-нуклеотидный продукт (P) указаны. ( D ) Графическое изображение процента расщепления для реакций, показанных в ( C ). Значения являются средними по крайней мере 2 различных эксперимента и полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040309.g003
Смешанные олигонуклеотиды RD были синтезированы, сняты защиты и очищены.Затем анализы расщепления проводили в условиях однократного оборота. Смешанные рибозимы со всей РНК и RD, содержащие исходный U ₂₃ / G ₂₈ нуклеотиды считались контрольными. Оба эти рибозима почти полностью расщепил весь субстрат через 2 часа инкубации (т.е.> 95%) (Рисунок 3C, D). Три все другие смешанные рибозимы RD проявляли активность расщепления, хотя и в разных уровни (Рисунок 3C, D). Тот, который содержал I ₂₈, был так же активен, как и оригинальный Rz, содержащий G ₂₈, достигая конечной точки расщепления 96%.Это в согласие с идеей, что группа NH ₂ G ₂₈ является не является существенным для каталитического действия рибозима (см. рисунок 3A). Смешанные рибозимы RD, содержащие замены 2AP ₂₈ и N7D ₂₈ имели конечные точки расщепления которые были снижены до 72% и 22% соответственно. Эти результаты предполагают вклад групп O6 и N7 в активность расщепления. Кинетический анализ псевдопервого порядка, выполняемый для уточнения вкладов этих групп, показали, что RD смешал рибозим с исходным U ₂₃ / G ₂₈ пара оснований, расщепленная со значениями k ₂ и K _{M ’}, равными 0.36 min ⁻¹ и 79 нМ соответственно (табл. 1). Соответствующие значения, оцененные для смешанного рибозима RD, включали остаток I ₂₈, были почти идентичны (т.е. 0,24 мин ^-1 и 70,4 нМ соответственно), что подтверждает идею о том, что удаленный NH ₂ группа не участвует во взаимодействии, которое приводит к образованию ни базовые пары t WW или t WH GU. Кроме того, для этой замещенной смеси RD не наблюдалось никакого эффекта в отношении K _Mg. рибозим (т.е. его K _Mg составлял 7,4 мМ по сравнению с 6,4 мМ для оригинальный RD смешанный рибозим). В случае смешанного рибозима RD, включающего остаток 2AP ₂₈, значение k ₂ было в 20 раз меньше, в то время как K _{M ’} был уменьшен только в 2 раза по сравнению с оригинальным значения последовательности (т.е. 0,018 мин ^-1 и 44,2 нМ соответственно). Наконец, смешанный рибозим RD, несущий остаток N7D ₂₈, продемонстрировал k ₂ и 1.6-кратное увеличение K _{M ’} (0,0062 мин ^-1 и 125,6 нМ соответственно). Смешанный рибозим RD которые включали остаток 2AP ₂₈, имели значение K _Mg 15,1 мМ, а тот, который содержит остаток N7D ₂₈ составляла 13,8 мМ. Наблюдаемые изменения K _Mg довольно мягкие, что указывает на что либо группы O6 и N7 из G ₂₈, вероятно, участвуют в координирование иона Mg ²⁺ внутри петли III или что эти замещения вызывают структурные изменения рибозима, а не потерю связывания металлов лиганд.Однако было удивительно наблюдать, что удаление O6 не оказали более выраженного эффекта за счет удаления Н-связи в основании пара, особенно для возможной пары оснований t WH, где она теоретически должен удалить единственную образовавшуюся водородную связь (см. вставку на рис. 1А). Отсутствие большего эффекта для удаления группы O6 может быть признаком того, что как формирование Н-связи между группой N3H соединения U ₂₃ и группой O6 соединения G ₂₈, и то, что образовано сольватированным ионом магния, может быть тесно связано с связанный.
Формирование базовой пары
Trans Watson-Crick GU
Для того, чтобы пролить свет на точную дату формирования t WW Встречается пара оснований GU, химические исследования с использованием как кетоксала, так и 1-циклогексил- (2-морфолиноэтил) карбодиимида мето- p -толуолсульфонат (CMCT). Кетоксал ковалентно модифицирует как N1, химическую группу, участвующую в Н-связи образование пары оснований t WW GU (см. рисунок 1) и N2 групп гуанозина [30].Однако, реакция кетоксала не информативна для исследования возможности образования пары оснований t WH перед расщеплением шаг (т.е. тот, который включает только группу O6 гуанозина). CMCT реагирует в первую очередь с группами N3 и N1 уридина и гуанозина, соответственно [30], тем самым модифицируя две из химических групп, которые участвуют в Н-связях между U ₂₃ и G ₂₈ из trans Пара оснований Уотсона-Крика или в H-связи с участием группы N3 U ₂₃ в паре оснований trans Watson-Crick / Hoogsteen (рисунок 1).Кроме того, эти модификации также предотвращают обратную транскрипцию однонитевых нуклеотидов, таким образом создание остановки, которая приводит к появлению полосы за один нуклеотид до модифицированного гуанозина или уридина. Неактивные мутировавшие рибозимы, которые останавливать путь сворачивания на различных этапах (см. рис. 1B и Введение), а также версия после расщепления. инкубировали либо в отсутствие, либо в присутствии химического реагента перед быть переписанным. Затем полученные реакционные смеси анализировали. на денатурирующих гелях PAGE.Вместо использования trans — действующего HDV последовательности, цис -действующих версий были исследованы так, чтобы структурная однородность каждого мутанта. Кроме того, образцы РНК были предварительно инкубировали в присутствии MgCl ₂, шаг, который был показан иметь важное значение для некоторых этапов складывания, чтобы способствовать складыванию в активный конформация. Каждая cis -действующая конструкция содержала 3′-конец удлинение, которое не оказало значительного влияния на структуру рибозима согласно предыдущим зондирующим экспериментам [31], но позволял эффективное связывание используемого антисмыслового олигонуклеотида для удлинения праймера.Типичные полученные авторадиограммы показаны на рисунке 4 как для кетоксала. и зондирования CMCT. В отсутствие химического реагента существенного фона нет. наблюдали для всех мутантных рибозимов, за исключением расщепленного продукта рибозим, который всегда давал более сложный рисунок полос (рис. 4A, B). В присутствии кетоксала наблюдалась модификация большинства однонитевых гуанинов, в то время как двухцепочечные не были затронуты (например, стебли I и IV), как и ожидалось.Это указывает на то, что различные мутировавшие цис -действующие рибозимы были правильно сложены. Также очевидно, что область обоих псевдоузлов 1.1 и пара оснований гомопурина (G _40–42), по-видимому, различались в доступности по пути складывания, что позволяет предположить, что эти регионы очень динамичны, как уже сообщалось [31]. Остаток G ₂₈ оказался очень доступным для кетоксала. реакция во всех шести мутантах предварительного расщепления, но не в продукте расщепления конструкция (рис. 4А).Количественная оценка этих результатов указала на снижение интенсивности G ₂₈ — по крайней мере 2,5-кратная полоса в комплексе после расщепления по сравнению с к любому из предрасщепляющих (т. е. варьировалась от 2,5 до 5 раз в зависимости от на конструкции; данные не показаны).
Рис. 4. Химическое зондирование базы GU trans Watson-Crick. пара.
Различные мутанты cis -действующие складывались в присутствии MgCl ₂, а затем исследовали либо в отсутствие, либо в присутствии любого кетоксал ( A ) или CMCT ( B ).Образцы РНК были обратными транскрибируется, и затем реакции фракционируются на 8% денатурирующем ПААГ. гели. Визуализирована доступность либо G (кетоксала и CMCT), либо U (CMCT). наличием полос, которые смещают один нуклеотид вниз по сравнению с любым лестницу G или U, полученную с использованием необработанного рибозима дикого типа либо дидезокси-АТФ (ddA) или дидезокси-CTP (ddC) на стадии обратной транскрипции. Положение ксилолцианольного красителя (XC) и нуклеотидов G и U рибозимов указаны на обоих гелях.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040309.g004

В отличие от кетоксала, CMCT в меньшей степени реагировал с одноцепочечным гуанины, согласно литературным данным (рисунок 4Б). Однако снижение доступности G ₂₈ в также наблюдался пост-расщепляющий цис--действующий рибозим , хотя и в меньшей степени (в 2-3 раза), чем в экспериментах с кетоксалом. Зондирование CMCT U ₂₃ было более сложным, чем U ₂₃ сигнал зондирования оказался менее интенсивным, чем ожидалось, у всех мутантов. (Рисунок 4B).Это может отражают роль этого уридина в укладке стебля I, первый шаг на пути складывания HDV Rz. Это также может быть признаком наличие слабой пары оснований t WH, которая включает N3H уридин (см. рисунок 1А вставка) перед стадией расщепления. Количественная оценка доступности остаток в различных мутантах показал снижение сигнала 2- в 2,5 раза в комплексе после расщепления по сравнению со всеми комплексы пре-расщепления, за исключением G ₈₀ C-C ₇₆ G мутант, который дает полосу эквивалентной относительной интенсивности.Сигнала не было обнаружен для U ₂₃ A, как и ожидалось, поскольку мутация заменяет U ₂₃ по А ₂₃. Важно отметить, что в совокупности эти результаты указывают на то, что как U ₂₃, так и G ₂₈ антигеномного Версия HDV Rz могла образовывать trans Watson-Crick / Hoogsteen пара оснований перед расщеплением и основание trans Watson-Crick пара только после того, как произойдет расщепление.

В недавней публикации результаты моделирования кристаллической структуры и МД показали, что мутация каталитического цитозина (C ₇₆) может нарушить формирование пары оснований t WW GU, потенциально что приводит к неправильной интерпретации результатов [21].Поскольку три мутанта, использованные в этом исследовании, содержат мутации этого типа. из C ₇₆ (т.е. мутанты G ₈₀ C-C ₇₆ G, ΔU ₇₇ -C ₇₆ G и C ₇₆ G), это может объяснить, почему trans Watson-Crick образование пары оснований, по-видимому, происходит только после стадии расщепления. В целях чтобы проверить эту гипотезу, эксперименты были повторены с использованием trans -действующего версия первых двух мутантов (G ₈₀ C-C ₇₆ G, ΔU ₇₇ -C ₇₆ G) в котором сохранился C ₇₆.Кроме того, эти рибозимы были предварительно инкубировали в присутствии нерасщепляемого субстрата, в котором аденозин расположенный в положении -1, был заменен дезоксирибоаденозином (SdA _-1). В случае третьего мутанта (C ₇₆ G) сохранение C ₇₆ включает работу с рибозимом дикого типа в присутствии либо SdA ₋₁ аналог, или с 7-нуклеотидным 3′-конечным продуктом в для подтверждения образования комплекса после расщепления. Оба кетоксала и зондирования CMCT дали аналогичные наблюдения, а именно, что доступность как U ₂₃, так и G ₂₈ были значительно уменьшены в пост-расщепления и что U ₂₃, возможно, участвовал в взаимодействие на стадии предварительного расщепления.Это указывало на то, что trans Образование пары оснований Уотсона-Крика, вероятно, является результатом переключения trans Пара оснований Уотсона-Крика / Хугстина перед стадией расщепления до trans Пара оснований Уотсона-Крика после расщепления, а не необходимость для того, чтобы произошло расщепление (данные не показаны).

Локализация катионов Mg

²⁺ с помощью расщепления, индуцированного ионами металлов
HDV Rz зависит от присутствия ионов двухвалентных металлов как для сворачивание и его катализ.Три различных катиона магния имеют были примерно расположены в HDV Rz: один между стволами I и III, другой расположен рядом с парой оснований GU Wobble, расположенной внизу стебля I [11], а третья — вокруг IV / II соединение [32]. Более того, недавние кристаллографические данные геномного рибозима предполагают, что уникальный ион Mg ²⁺ взаимодействует как с ионами t WW ГУ петли III и низ стебля I [20]. Тем не менее, локализация этих ионов металлов вдоль всего рибозима HDV путь сворачивания еще не сообщается.Чтобы решить эту проблему, магний-индуцированный зондирования спайности были выполнены. Этот метод основан на том, что при более высокий pH, молекулы воды, окружающие ион магния, более кислые чем бесплатные [33]. Таким образом, образующийся ион магния, окруженный гидроксидом, может действовать как мощный нуклеофил, удаляя протоны из 2′-ОН остатков рибозы. Как следствие, гибкий каркас РНК, окружающий связанный магний может быть расщеплен посредством прямой атаки 5′-фосфата, в результате чего 2′-O ^— фрагментов рибозы.Эта техника была успешно использован для обнаружения скоординированного Mg ²⁺ расположен в нижней части ствола II в антигеномном Rz HDV [32].
Trans — действующие версии Rz всех обнаруженных мутантов. вдоль пути сворачивания были использованы для выполнения индуцированного Mg ²⁺ зондирование спайности. В отличие от химических исследований, которые были выполнены с цис -действующими последовательностями, которые также требовали замены из C ₇₆ через G ₇₆ в случае обоих G ₈₀ C и ΔU ₇₇ мутантов для получения Rz без какого-либо расщепления активности, здесь мутация каталитического цитозина не требуется, потому что эксперименты проводились с использованием транс -действующего рибозима. с нерасщепляемой подложкой.Все мутанты были мечены 5′-концом ³² P, смешивали или не смешивали с нерасщепляемым аналогом SdA _-1, а затем инкубировали в слегка щелочном буфере в течение 48 ч в присутствии MgCl ₂. В для получения информации о продукте пост-расщепления, активном рибозиме также инкубировали в присутствии 3′-концевого продукта. Во всех случаях, полученные образцы фракционировали на денатурирующих гелях для ПААГ. Сначала На первый взгляд, фосфодиэфирный остов оставался нетронутым в отсутствие магния. ion (рисунок 5, дорожка -), предполагая, что полосы гидролиза наблюдаются для всех других реакции, вероятно, подразумевали специфическое связывание иона металла.В целом аналогичные полосатость наблюдалась для всех комплексов. Например, стержень Я казался защищенным в большей степени в присутствии либо SdA ₋₁ аналог или 3′-конечный продукт по согласованию с тот факт, что эта область во всех случаях стала двухцепочечной. Более того, нуклеотиды стебля IV кажутся менее гибкими, когда стебель I формируется, предполагая, что формирование этого последнего ствола приводит к более стабильному структура рибозима [32]. Однако заметная разница в количестве полос может наблюдаться для комплекс после расщепления по сравнению с комплексами до расщепления.Этот в соответствии с более ранним отчетом, что конформационный переключатель контролирует HDV Rz катализирует и приводит к более компактной структуре после расщепления [7]. Более того, два основные регионы демонстрируют относительно высокую доступность почти во всех реакции: области петли III и соединения IV / II, которые в основном одноцепочечные до образования каких-либо специфических третичных взаимодействий вдоль складчатости путь и, как известно, связывают ионы магния [11]. Единственным исключением является мутант G ₈₀ C, у которого соединение IV / II был менее доступен, чем у других мутантов.Этот результат можно объяснить необходимостью сохранения G ₈₀ для правильной привязки ион магния, ведущий к переключателю пары оснований в нижней части стержня II. Третья предполагаемая область связывания магния, а именно нижняя часть стебля I, кажется менее гибким, хотя и U ₃₉, и G ₄₀ чувствительны к расщеплению в некоторых реакциях. Еще раз, главное различие в образцах полос наблюдали с комплексом после расщепления. Это различие связано с полным отсутствием какого-либо индуцированного расщепления, окружающего эта область, предполагая, что этот предполагаемый сайт связывания магния стал ограничен, или что этот ион металла был выброшен после стадии расщепления (рис. 5, середина геля).Взятые вместе, эти результаты подтверждают присутствие ионов магния в этих три области рибозима.
Рис. 5. Глобальная локализация магния вдоль пути сворачивания HDV Rz. изучены с помощью расщепления, индуцированного магнием.
Различные мутантные рибозимы, меченные 5′-концом, транс, которые останавливают путь сворачивания на каждом известном промежуточном соединении сворачивания HDV Rz, были свернутый либо в отсутствие, либо в присутствии (+) субстрата SdA-1, либо 3′-конечный продукт. Затем зондирование продолжалось в течение 48 часов при комнатная температура в присутствии 50 мМ Трис-HCL (pH 8.3) и 20 мМ MgCl ₂. Также была проведена контрольная реакция без MgCl ₂ (-). Полученные пробы анализировали на 8% денатурирующих гелях для ПААГ. В позиции красителя бромфенолового синего (БПБ) и различных областей Rz указаны справа от геля. Полосы, обозначенные как «Лестницы» и «T1» представляют собой щелочной гидролиз и рибонуклеазу T1 (РНКаза Т1) картирование версии рибозима дикого типа, соответственно. Типичные остатки гуанозина указаны слева от геля.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040309.g005
Подробный анализ полосатости остатков, образующих оба области соединения IV / II и петли III выявили несколько различий между различные мутанты. Во-первых, только U ₇₇ (который участвует в трилистник-поворотный) и G ₈₁ (который выпирает после переключателя bp) были доступны в соединении IV / II комплекса пост-расщепления, тогда как все нуклеотиды в различных комплексах предварительного расщепления были доступны, хотя в разной степени (рис. 5, верхняя часть геля).Этот результат предполагает, что магний ион, расположенный около соединения IV / II, стабилизируется только в комплексе после расщепления, в соответствии с предыдущими отчетами [8], [32]. Все известные структурные третичные взаимодействия, включая образование после расщепления пары оснований t WW GU, расположенной в петле III, вероятно требуется для правильного связывания этого иона металла. В случае петли III, хотя интенсивности полос меньше, чем у перехода IV / II, значительные изменения в рисунках полос, полученных при складывании пути не наблюдались.Интенсивности полос, соответствующих нуклеотидам 23-27 оказались слабыми по сравнению с таковыми из другого предварительного расщепления. продукты (рисунок 5, внизу геля; нуклеотиды U ₂₃, C ₂₄, C ₂₇ и, в меньшей степени, как U ₂₆, так и G ₂₈) с обоими начальными U ₂₃ Rz-мутант и комплекс пост-расщепления. Учитывая, что было продемонстрировано, что ион магния абсолютно необходим для стыковка подложки, процесс, который предотвращен в U ₂₃ A Rz-мутант, и было показано, что U ₂₃ находится в непосредственной близости к нуклеотидам, расположенным в середине цепи субстрата (в частности, нуклеотид +4) экспериментами по перекрестному связыванию [4], кажется разумным предположить, что Mg ²⁺ -катион связан в петле III на этом начальном этапе, который следует за связыванием субстрата к рибозиму.Более вероятно, что взаимодействия между остатками петли III и этот конкретный Mg ²⁺ -катион модифицируется, когда t WW Пара оснований GU образуется в продукте пост-расщепления и, в свою очередь, приводит к в модификации рисунка полос для этого региона. В качестве альтернативы, это возможно, хотя и менее вероятно, что этот катион Mg ²⁺ вытеснен и заменен другим, который специально взаимодействует с t WW Базовая пара ГУ.
Наконец, было обнаружено, что нуклеотид C ₂₉ был доступен по всей длине пути сворачивания, что позволяет предположить, что этот остаток либо очень гибок, либо всегда выпячивается.Этот нуклеотид был показано, что они являются одними из наименее консервативных из петли III в проведенных экспериментах SELEX. с антигеномным HDV Rz [18], вероятно, демонстрируя, что он не участвует в каких-либо конкретных взаимодействиях. Таким образом, связывание ионов металлов подразумевает структурную перестройку HDV Rz, особенно для областей петли III и соединения IV / II. Этот особенно очевидно в комплексе после расщепления, и позиционирование ионов магния до расщепления кажется более динамичным и менее более строгие, чем после, подразумевая предполагаемое формирование t WW Базовая пара ГУ.
Структурное моделирование комплексов до и после расщепления
Трехмерное представление конкретных взаимодействий между РНК молекулы — мощный инструмент в интерпретации кинетических данных. За это Причина в том, что 3D-моделирование проводилось как до, так и после этапа скола. антигеномного HDV Rz, действующего на цис , с использованием MC-Sym [34]. В этом программном обеспечении используется циклический строительные блоки, извлеченные из кристаллографических данных для решения ограничения проблема удовлетворения на основе вторичной структуры.Это было успешно используется в 3D-моделировании различных промежуточных продуктов предварительного расщепления вдоль Путь сворачивания рибозима HDV [31]. Чтобы получить доступ к конформационным изменениям, происходящим во время расщепления реакция, набор моделей MC-Sym был разработан на основе известных взаимодействий обнаружены как в пре-, так и в пост-расщепленных структурах. В случае предварительно расщепленного структур, цис -действующая последовательность, которая включала четыре дополнительных Использовали нуклеотиды, расположенные перед сайтом расщепления.Три сценария были написаны для моделирования структур, присутствующих непосредственно перед реакцией расщепления. Эти сценарии включают все функции, которые, как известно, необходимы для производства. активного рибозима, а именно стыковка субстрата, псевдоузел I.I, Мотив ля минор, переключатель пары оснований GC и поворот трилистника. Первый сценарий представляет базовую пару t WH GU с G ₂₈ в anti в структуры предварительного расщепления, а вторая и третья вводят базовая пара t WW GU, с G ₂₈ в syn и отсутствие пары оснований GU (отрицательный контроль) соответственно.В случае постколого структуры, последовательность, идентичная той, которая используется для предварительно расщепленных структур был использован, за исключением того, что он был укорочен на четыре остатка на 5′-конце (то есть последовательность, точно соответствующая расщепленному цис -действующему рибозим). Те же сценарии, что и выше, за исключением отрицательного контроля, были использованы для моделирования структур, присутствующих сразу после реакции расщепления. и включали те же структурные особенности, что и предварительно расщепленные структуры.Все строки кода, написанные вручную, необходимые для третичной структуры Пары оснований GU можно найти в разделе Поддержка Информация S1.
Каждый из этих пяти различных сценариев дал сопоставимое количество структур, варьируется от 8 до 12, тем самым утверждая, что третичные структуры основаны только на на нуклеотидах вторичные и третичные взаимодействия не могут объяснить стабилизация после расщепления, по крайней мере, с использованием программного обеспечения MC-Sym. Этот результат также демонстрирует относительную гибкость петли III, более конкретно его способность переносить различные структурные конформации.После минимизации все полученные структуры были визуализированы с помощью Visual Molecular Программное обеспечение динамики (VMD) [35]. Наиболее репрезентативные структуры как до, так и после расщепления семейств были отобраны на основании как их стабильности, так и их среднего среднеквадратического отклонения (см. рисунок 6А). В целом полученные очень компактные структуры были похожи на полученные ранее кристаллографией [6]. Вкратце, все известные третичные взаимодействия или структурные перестройки которые имеют место в HDV Rz, видны, демонстрируя, что моделирование MC-Sym обладает способностью создавать структуры, удовлетворяющие сложной сети взаимодействий рибозима HDV.
Рис. 6. Структура MC-sym, изображающая формирование trans Пара оснований Watson-Crick GU после стадии расщепления.
( A ) Типичная структура рибозима HDV после расщепления. ( B ) Подробный вид стереодиаграмм петли III как перед (содержащие базовая пара т WH GU, верхняя панель) и после (содержащая т WW Базовая пара ГУ, нижняя панель) ступень скола. Цвета гармонируют как на рисунке 1.
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0040309.g006
Более пристальный взгляд на цикл III выявил несколько интересных особенностей в обоих пред- ( т WH GU пара базовой пары) и пост- ( т WW Пара оснований GU) структуры расщепления (рис. 6Б). Например, C ₂₉ выпячивается в пост-расщеплении. структура и поэтому не участвует в каком-либо конкретном взаимодействии, по согласованию с результатами, полученными при расщеплении, индуцированном Mg ²⁺ (рис. 6В, нижняя панель). В структура предварительного расщепления, этот нуклеотид кажется очень динамичным.На основании по этим результатам C ₂₉ не всегда складывается между G ₂₈ и G ₃₀, как показано на рисунке. 6B (верхняя панель), доказывая, что эта область очень гибкая и может стабилизироваться присутствием иона магния (данные не показаны). Эта стабилизация может привести к окончательному выпиранию этого C ₂₉, как это происходит в структуре после расщепления (рис. 6Б, нижняя панель). Базовая пара ГУ т WW в сравнении к базовой паре ГУ t WH (рис. 6B, верхняя панель), по всей видимости, укладывается под шток III в большинстве компактные конструкции и, кажется, запускает, в свою очередь, штабелирование обоих U ₂₆ и C ₂₇ под себя.Скорее всего, эти взаимодействия стекирования приводят к более стабильной, структурированной петле III, гипотеза, которая подтверждается по моделям гидролиза, наблюдаемым во время индуцированного магнием расщепления экспериментов (т.е. снижение степени гидролиза всех этих нуклеотидов в структуре пост-расщепления).
Обсуждение
Два нуклеотида, участвующих в G ₂₈ U ₂₃ пары оснований было показано, что они совершенно сохраняются во всех естественных вариантах и не могут быть мутировали индивидуально без ущерба для уровня расщепления.В Фактически, они считаются частью подписи каталитического ядра HDV Rz как геномной, так и антигеномной полярностей [17]. Хотя оба эксперименты по дифракции рентгеновских лучей и ядерному магнитному резонансу обеспечили информация с высоким разрешением о третичной структуре HDV Rz [6], [7], [19], [20], включая свидетельства формирования т WH или т WW Пара оснований GU в петле III, пока нет прямых экспериментальных результатов о потенциале взаимодействия между этими основаниями (ни роли конкретных химических групп внутри этой пары оснований) был получен в растворе.Насколько нам известно, этот отчет представляет собой первый случай, когда эти нуклеотиды были одновременно мутировал. Лишь ограниченный набор этих мутантов оказался активным, и даже тогда полученные активные рибозимы показали значительно меньшее расщепление активности, чем у естественной пары оснований (U ₂₃ / G ₂₈) (Рисунок 2). Единственный двойной мутант проявляла активность комбинация оснований C ₂₃ / A ₂₈, который способен образовывать базовую пару trans Watson-Crick изостерический к t WW U ₂₃ / G ₂₈ пара оснований присутствует в версии рибозима дикого типа.Все остальные ферментативно активные мутанты возникли в результате однократной замены либо U ₂₃, либо Г ₂₈. Все полученные комбинации активных нуклеотидов имеют потенциал для образования изостерических или почти изостерических пар оснований в t WW геометрия, а также t WH, найденный в кристалле Rz до раскола. Однако концепция изостерии — не единственный важный параметр. к этой паре оснований, как некоторые изостерические мутанты (например, G ₂₃ / U ₂₈ и A ₂₃ / C ₂₈) неактивны.Фактически, уже было предложено, чтобы структурная гибкость петли III в геномном HDV Rz закрывается закрытием этого t WW Базовая пара ГУ. Это замыкание позволяет не только протонированному C ₇₅ H ⁺ -индуцированному конформационный переключатель, но также создает электростатическую среду, которая влияет как на каталитическую силу цитозина, так и на правильный металл связывание ионов [36]. Следовательно, пространственное расположение функциональных групп, участвующих в расположение иона магния (O6 и N7 из G ₂₈ и O2 из U ₂₃) кажутся также важными.Это требование также может объяснить предполагаемый переключатель от базовой пары t WH с G ₂₈ в anti конфигурация с базовой парой t WW с G ₂₈ в конфигурации syn (см. рис. 1А врезка). Частичное развертывание петли III потребуется для того, чтобы перевернуть G ₂₈ с 180 ° и, таким образом, обеспечить правильное позиционирование его края Хугстина, который участвует в связывании иона магния, без разрыва единственной водородной связи между O6 G ₂₈ и N3H У ₂₃.Кроме того, получившиеся тн ВВ ГУ базы пара создает вторую водородную связь между N1H G ₂₈ и O4 из U ₂₃, тем самым стабилизируя пары оснований. Следовательно, концепция относительной стабильности водородных связей до (более слабая) и после (более сильная) шаг расщепления кажется важным параметром, который может объяснить крайняя сохранность обоих этих нуклеотидов в природе. Более того, это может объяснить, почему мутанты, позволяющие образовывать пары оснований Уотсона-Крика до стадии расщепления не активны.Например, слегка активный U ₂₃ / A ₂₈ мутант может образовывать 2 Н-связи с помощью обычных цис Пары оснований Уотсона-Крика, которые должно быть трудно сломать, чтобы сформировать пара оснований trans Watson-Crick, обнаруженная в расщепленном товар.
Замена определенных химических групп дает физические доказательства поддерживая образование пары оснований t WW GU после расщепления, или, по крайней мере, традиционного GU Wobble, а не классического Watson-Crick, пара оснований (рисунок 3).Удаление группы NH ₂, которая связана с C2 гуанина (т.е. он участвует в образовании Н-связи внутри цис-цепи Watson-Crick GC bp), как это происходит, когда остаток инозина вставлен в положение 28, не влияет на активность расщепления. Отсутствие N7 на Hoogsteen край 7-дезазагуанина привел к относительно значительному снижению в активности расщепления, подтверждая идею связывания Mg ²⁺ ион к химической группе N7 G ₂₈.Этот вывод также подтверждается по результатам эксперимента по индуцированному магнием расщеплению в петле III. Все вместе, данные убедительно свидетельствуют о локализации катиона вблизи петли III, более в частности рядом с G ₂₈. Важно отметить, что оба последних эксперимента и химические исследования с кетоксалом и CMCT в антигеномной версии Исследования показали, что базовая пара ГУ т WW формируется исключительно в каталитическом ядре рибозима после расщепления, и это, возможно, t WH Пара оснований GU образуется на этапах предварительного расщепления, хотя экспериментальных данных нет. доказательства в этом исследовании, которые подтверждают присутствие транс Пара оснований Уотсона-Крика / Хугстина до расщепления.Следовательно, результаты представленные в этом исследовании неоспоримо указывают на формирование t WW Пара оснований GU является событием после расщепления.
Эксперименты, проведенные в этом исследовании, пролили свет на природу взаимодействие, которое происходит в рамках цикла III, а также его время относительно пути сворачивания. Начиная с т WW ГУ база пара была обнаружена только в комплексе пост-расщепления, либо она образуется после химическая стадия (на стадии пост-расщепления) или во время перехода сложный.Поскольку взаимодействие происходит так поздно на пути сворачивания, разумно усомниться в его точном вкладе в молекулярный механизм. Как показало моделирование MC-Sym, выполнение ограничения расстояния необходимая для формирования пары оснований т WW GU приводит к образование более структурированной петли III (рис. 6). Однако это, по-видимому, скорее следствие, чем вклад в механизм. Заманчиво предположить, что образование двух Н-связей в паре оснований t WW GU, а также реструктуризация петли III и правильное расположение магнезим-иона, скорее всего, стабилизируют основное состояние комплекса после расщепления и, в свою очередь, благоприятствует переднему реакция.Эта гипотеза подтверждается недавним анализом кристаллов, который предположили, что геномный HDV Rz имеет сайт выхода для 5′-конца продукт расщепления, для которого нет прямого взаимодействия с рибозимом керн зарегистрирован на сегодняшний день [20]. Этот сайт выхода состоит из пяти нуклеотидов, включая G ₂₅ (G ₂₈ для антигеномного Rz). Место выхода указывает на группу PO ₄. продукта расщепления 5′-конца, что позволяет быстро высвобождать 5′-конечный продукт.Это согласуется с отсутствием каких-либо сообщений реакция лигирования на рибозим HDV. Насколько нам известно, это первый время, когда взаимодействие, которое происходит после стадии расщепления рибозима может обеспечить дополнительную движущую силу для однонаправленной реакции.
Образование пары оснований t WW GU в петле III составляет еще один шаг по пути сворачивания рибозима HDV, путь сворачивания которому на протяжении многих лет уделялось значительное внимание.Этот путь включает 6 шагов, которые происходят до события расщепления, от образования комплекс субстрат-рибозим для образования трилистника в месте соединения IV / II (см. Рисунок 1). Скорее всего, одновременно со стадией расщепления 5′-конечный продукт выпускается и формируется базовая пара ГУ т WW. Формация этой базовой пары т WW может также помочь освободить 5′-конец товар. Наконец, 3′-конечный продукт, который, как было показано, остается связанный с рибозимом при определенных условиях, в конечном итоге высвобождается.Этот путь складывания кажется линейным; однако кинетические ловушки, которые можно реинтегрировать в продуктивный путь также сообщалось [4]. Тем не менее, формирование пары оснований t WW GU, скорее всего, происходит после расщепления шаг, и может служить для «движения» к конечной точке катализа.
Молекула РНК обладает иерархической структурой, в которой первичный нуклеотидная последовательность определяет вторичную структуру, которая, в свою очередь, определяет третичное складывание в процессе, который лишь минимально изменяет вторичный структура.Более конкретно, молекула сворачивается последовательно от 5 ‘ до 3 ′. Промежуточные звенья складчатости становятся все более стабильными. во время этого процесса, и поэтому следуйте процессу воронки. Однако число возможных различных структур, которые могут быть извлечены во время этого процесса, неизвестный. Чтобы дать представление о том, как именно взаимодействия способствуют уменьшению количества различных структур, MC-Sym эксперименты по моделированию проводились для каждого промежуточного звена с использованием расчета время 240 часов, чтобы позволить MC-Sym найти все потенциальные структуры и не только лучшие (т.е. стремиться к насыщению числа возможных конструкций). В результате этого процесса было получено 1750 структур для начального стадия образования комплекса субстрат-рибозим (т.е. через стебель I) и только 8 для комплекса пострасщепления, включающего t WW Базовая пара ГУ (рисунок 7). Этот эксперимент обеспечивает обогащение более чем в 200 раз, что на самом деле недооценивается как постоянное увеличение количества конструкций со временем наблюдалось для начального шага (т.е. нет тенденции к насыщению). Кроме того, свободный рибозим (т.е. до образования стебля I), как известно, относительно гибкий; следовательно, он может принимать множество различных структур. Более что важно, количество структур уменьшалось на каждом последующем шаге, как и ожидалось. Следует отметить, что это остается упрощенным способом, в котором чтобы оценить количество конструкций, и важно учитывать, что нет никаких результатов, подтверждающих существование всех этих различных видов.Кроме того, нерелевантные структуры, в том числе с очень малой вероятностью извлеченных, не были удалены из выборок. Также возможно что некоторые третичные структуры могут встречаться в разном порядке в зависимости от следовал путь сворачивания, что здесь не принимается во внимание.
Материалы и методы
Шаблоны ДНК рибозима
Были получены матрицы ДНК, соответствующие мутировавшим рибозимам. с использованием двух перекрывающихся ДНК-олигонуклеотидов (Прямой олигонуклеотид: 5′-TAATACGACTCACTATAGGGTCCACC (N) CCTC (N) CGGTCCGACCTGGGCATGCGGCTTCGC-3 ‘ и обратный олигонуклеотид: 5’-GGGTCCCTTAGCCATGCGAAGCCGCATGCCCAGGTCGGACCG-3 ‘, в котором подчеркнутые нуклеотиды представляют последовательность промотора Т7, которая был включен для обеспечения транскрипции РНК, а N представляет собой любой из четыре возможных нуклеотида).Та же стратегия была использована для производства цис -действующих рибозимов, за исключением того, что прямой олигонуклеотид содержит дополнительную последовательность (либо 5′-GGGCTAAGGGTCGGCA-3 ‘ или 5’-GGGTCGGCA-3 ‘ (отщепленный продукт) сразу после последовательности промотора Т7. Обратный олигонуклеотид также содержал дополнительную последовательность (5’-GTTTGTTTGTTTGTTGAGG-3 ‘) расположен в 3’-концевой области рибозима, чтобы обеспечить возможность отжига олигонуклеотида ДНК во время обратной транскрипции. Реакции наполнения были выполнены в конечном объеме 100 мкл, содержащем 20 мМ Трис-HCl. (pH 8.8), 10 мМ KCl, 10 мМ (NH ₄) ₂ SO ₄, 2 мМ MgSO ₄, 0,1% Triton X-100, 200 мкМ каждого дНТФ, 1 мкМ каждого ДНК-олигонуклеотида и 5 единиц ДНК-полимеразы Pwo (Диагностика Рош). Продукты реакции осаждали этанолом, промывали. и полученные осадки ДНК растворяли в 56 мкл деионизированной воды.
Синтез РНК
Транскрипцию
РНК проводили, как описано ранее [31]. Вкратце, растворенные Осадки ДНК (56 мкл) использовали в реакциях транскрипции на 100 мкл. содержащий 80 мМ HEPES-KOH (pH 7.5), 24 мМ MgCl ₂, 2 мМ спермидин, 40 мМ DTT, 5 мМ каждого NTP, 0,01 ед. Пирофосфатазы (Roche Diagnostics), 20 единиц ингибитора РНКазы RNaseOUT (Invitrogen) и 10 мкг очищенного РНК-полимераза Т7. Реакции инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C и подвергали анализу. затем обрабатывали 4 единицами ДНКазы RQ1 (Promega) перед получением фенол-хлороформа извлечен. Затем РНК осаждали этанолом, промывали и, наконец, растворяли. в 40 мкл деионизированной воды. Загрузочный буфер (40 мкл; 97,5% формамид, 0.05% бромфенолового синего, 0,05% цианола ксилола, 10 мМ EDTA), и образцы фракционировали на 8% денатурирующем (8 M мочевина) полиакриламидные гели (ПААГ, соотношение акриламида и бисакриламида 19 ± 1) с использованием 45 мМ трис-бората (pH 7,5) и 1 мМ раствора EDTA в качестве рабочего буфера. РНК визуализировали с помощью УФ-затемнения, срезы геля соответствовали желаемые полосы были вырезаны, и РНК элюировалась в течение ночи в 500 мМ аммония. ацетат, 1 мМ EDTA и 0,1% раствор SDS. После осаждения этанолом транскрипты РНК растворяли в деионизированной воде и количественно определяли спектрометрическим методом. на 260 нм.Субстрат РНК без защиты (5′-CUAAGGGUCGG-3 ‘), SdA _-1 аналог (5′-CUAdAGGGUCGG-3 ‘) и продукт расщепления с 3′-конца (5’-GGGUCGG-3 ‘) были приобретены у IDT. Смешанные РНК-ДНК рибозимы включая модифицированные остатки, приобретенные у Dharmacon, со снятыми защитными группами и очищают на гелях PAGE, как описано выше.
Радиоактивная маркировка видов РНК и ДНК
Очищенные рибозимы (50 пмоль) дефосфорилировали с использованием 5 единиц Антарктического фосфатаза, как предписано производителем (New England BioLabs), с последующим путем тепловой инактивации фермента в течение 8 мин при 65 ° C.Дефосфорилированный РНК (5 пмоль) метили на 5′-конце, инкубируя ее при 37 ° C в течение 1 часа. в конечном объеме 10 мкл, содержащем 3,2 пмоль [γ- ³² P] -АТФ (6000 Ки / ммоль, New England Nuclear), 50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCl ₂, 50 мМ KCl и 3 единицы полинуклеотидкиназы Т4 (USB). Реакции прекратились добавлением 10 мкл загрузочного буфера (97,5% формамида, 0,05% бромфенолового синего, 0,05% цианола ксилола, 10 мМ ЭДТА) и очищенной РНК денатурируя PAGE, как описано выше.Мечение на 5′-концах либо субстраты РНК или олигонуклеотиды ДНК, используемые в обратной транскрипции реакции проводили с использованием 5 пмоль, как описано выше, и продукты очищен 20% денатурирующим ПААГ.
Анализ конечной точки расщепления
Анализы конечной точки расщепления проводили путем подготовки 18 мкл реакционной смеси. содержащие следовые количества (≤1 нМ, 50000 CPM) меченого на 5′-конце субстрата и 2 пмоль желаемого рибозима (конечная концентрация 100 нМ), а затем нагревание при 65 ° C в течение 2 минут, затем 2 минуты на льду и 5 минут при 37 ° C.Затем, 2 мкл раствора, содержащего 500 мМ Трис-HCl (pH 7,5) и 100 мМ MgCl ₂ были добавлены, и всю реакционную смесь инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов. В реакции останавливали добавлением 20 мкл загрузочного буфера, фракционировали на 20% денатурирующих гелях для ПААГ, которые затем подвергали воздействию PhosphorImager экраны и сканированные с помощью аппарата Typhoon (GE Healthcare). Активность каждого рибозима определяли с помощью ImageQuant (Molecular Dynamics) программного обеспечения, и выражается как процент расщепленного продукта, превышающий общее количество.Каждая конечная точка рассчитывалась по результатам не менее 2 самостоятельные эксперименты.
Кинетический анализ
Кинетические анализы были выполнены в условиях однократного оборота, как описано ранее. Вкратце, следовые количества субстрата, меченного 5′-концом (≤1 нМ, 50 000 CPM) были расщеплены различными концентрациями рибозима (6,25–1600 нМ). Расщепленные фракции определяли, как описано выше, и скорость расщепления (k _obs) было получено путем подгонки данных к уравнению A _t = A _∞ (1-e ^−kt) где A _t — процент расщепления в момент времени t, A _∞ — максимальный процент расщепления (или конечная точка расщепления), а k — скорость постоянная (k _obs).Каждая константа скорости рассчитывалась как минимум из 2 независимых эксперимента. Затем были получены значения k _obs. график как функция концентрации рибозима для определения другого кинетического константы (k ₂, K _{M ’} и k ₂ / K _M’). Зависимость от магния для каждого рибозима изучали путем инкубации реакции смеси с различными концентрациями MgCl ₂ (0,5–64 мМ) в наличие избытка рибозима (500 нМ) над субстратом (≤1 нМ, 50000 CPM).Концентрации магния на половине максимальной скорости (K _Mg) также были определены.
Химические исследования
Cis -действующий рибозим (5 пмоль), растворенный в воде (18 мкл) нагревали при 65 ° C в течение 2 минут, помещали на лед на 2 минуты и затем инкубировали при 37 ° C в течение 5 мин. Раствор (2 мкл), содержащий 500 мМ HEPES-KOH. (pH 7,5), 100 мМ MgCl ₂ и 100 мМ NaCl для реакции кетоксала, или 200 мМ бората калия (pH 8,0), 100 мМ MgCl ₂ и 100 мМ NaCl для реакции CMCT, затем добавляли и реакционную смесь инкубировали при 37 ° C. на 15 мин.Химическое зондирование инициировали добавлением 0,5 мкл либо кетоксал (20 мг / мл в 20% этаноле; Aldrich), либо 1-циклогексил-3- (2-морфолинометил) карбодиимид мето- p -толуолсульфонат (CMCT) (84 мг / мл в вода; MP Biomedicals) и инкубируют реакции при 37 ° C в течение 5 мин. Отрицательные контроли выполняли добавлением 0,5 мкл либо 20% этанол (кетоксал) или вода (CMCT) вместо химического агента. Реакции гасили добавлением 20 мкл 50 мМ бората калия (pH 7.0), а РНК осаждали этанолом в присутствии 10 мкг гликогена. (Диагностика Рош). Полученные осадки промывали этанолом и растворяли. в 12 мкл 50 мМ бората калия (pH 7,0), содержащего 1 пмоль 5′-конца радиоактивно меченый ДНК-олигонуклеотид (5′-GTTTGTTTGTTTGTTGAGGG-3 ‘) (50 000 CPM). Затем образцы нагревали при 65 ° C в течение 5 мин, охлаждали при температуре 37 ° C в течение 5 минут и, наконец, инкубировали при 4 ° C в течение 1 минуты. На этой точке, 4 мкл 5-кратного буфера для первой цепи (Invitrogen), 1 мкл 100 мМ DTT, Добавляли 1 мкл 10 мМ dNTP и 2 мкл ДМСО, и реакции предварительно инкубировали при 56 ° C в течение 1 мин перед добавлением 100 единиц SuperScript III (Invitrogen) и инкубируют еще 20 мин при 56 ° C.В случае лестницы, необработанной РНК и дополнительно 1 мкл либо 10 мМ В реакции использовали ддЦТФ или 10 мМ ддАТФ. Реакции прекратились добавляя 1 мкл 4 н. NaOH, а затем нагревали при 95 ° C в течение 5 мин. так, чтобы гидролизовать РНК. Затем вновь синтезированную кДНК осаждали этанолом, растворяют в 10 мкл загрузочного буфера и фракционируют на 8% денатурирующем PAGE гели. Гели экспонировали на экранах PhosphorImager, сканировали с использованием прибор Typhoon (GE Healthcare) и интенсивность полос, определенная количественно с использованием программное обеспечение ImageQuant (Molecular Dynamics).Фон с реверса реакцию транскрипции вычитали, используя результат, полученный либо с РНК, обработанная этанолом (кетоксалом) или водой (CMCT). Оба нуклеотида U ₂₃ и G ₂₈ были количественно определены и нормализованы относительно интенсивности нуклеотидов U ₅₁ и G ₄₉ из петли IV для которых сигналы были постоянными независимо от условий эксперимента. Каждый представленный результат химического зондирования был рассчитан как минимум на 2 независимых эксперименты.
Расщепление, индуцированное магнием
Реакции (18 мкл), содержащие следовые количества (≤1 нМ, 50 000 CPM) рибозима, меченного 5′-концом, с 20 пмоль или без них нерасщепляемый аналог SdA _-1 или продукт расщепления с 3′-конца (Конечная концентрация 1 мкМ) нагревали при 65 ° C в течение 2 мин, надевали лед в течение 2 мин, а затем инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Решение (2 мкл), содержащий 500 мМ Трис-HCl (pH 8,5) и 200 мМ MgCl ₂ затем добавляли и реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 48 часов.А отрицательный контроль (без MgCl ₂) проводили путем добавления 2 мкл 500 мМ трис-HCl (pH 8,5). После реакции РНК осаждали этанолом. в присутствии 10 мкг гликогена, и полученный осадок затем растворяют в 10 мкл загрузочного буфера. Для щелочного гидролиза 50000 СРМ меченного 5′-концом рибозима (<1 нМ) растворяли в 5 мкл. воды, добавляли 1 мкл 2 н. NaOH и реакционную смесь инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре перед гашением добавлением 3 мкл 1 М трис-HCl (pH 7.5). Затем РНК осаждали этанолом в присутствии 10 мкг гликогена и растворенный в 10 мкл загрузочного буфера. Лэддер РНКазы T1 получали с использованием 50000 CPM меченного 5'-концом рибозима. (<1 нМ) растворяют в 10 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl (pH 7.5), 10 мМ MgCl ₂ и 100 мМ LiCl. Смесь инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре в присутствии 0,6 единицы РНКазы T1 (Roche Diagnostic), и затем реакцию гасили добавлением 20 мкл загрузочного буфера.Образцы фракционировали на 8% денатурирующих гелях для ПААГ, которые подвергали анализу. затем экспонируется на экранах PhosphorImager.
MC-Sym
Вся информация, необходимая для создания, редактирования и оптимизации скриптов. используемые в программе MC-Sym можно найти на веб-странице MC-Pipeline (http://www.major.iric.ca/MC-Pipeline). Три основных шаблона, используемых для сворачивания рибозима HDV (один шаблон для вторичная структура, одна для вторичной структуры, включая псевдоузел I.I и один для вторичной структуры, включающий оба псевдоузла I.я и GC bp-switch) были опубликованы ранее [31]. Во всех этих шаблонах порядок строительства третичных структур начался со стебля I, затем стебель III, петля III и псевдоузел I.I (при наличии), за которым следует низ стебля II, соединение IV / II, вершина стебля IV, соединение I / IV (когда псевдоузел I.I отсутствует), стержень II, соединение I / II, стержень IV и, наконец, 5′-конец рибозима. Все строки кода, написанные вручную, необходимые для третичную структуру пар оснований GU можно найти в вспомогательной информации S1.На каждой позиции Было испробовано 25% циклических строительных блоков, возврат составил 25%. конструкции и метода были вероятностными. Максимальное количество конструкций было зафиксировано на уровне 10 000, время расчета — 240 ч, а минимальная разница между двумя структурами до 1 Å. Энергия структур минимизирована. до тех пор, пока среднеквадратичный градиент (GRMS) не станет <0,1 ккал / моль / А непосредственно на веб-сервере.
Лампа LED MR16 с регулируемой яркостью 5 Вт GU 5.3 Цоколь Алюминиевый корпус Теплый белый 2700K Дом и сад
Лампа светодиодная MR16 диммируемая 5Вт ГУ 5.Алюминиевый корпус с 3 цоколями, теплый белый 2700K Дом и сад
Дом
Дом и сад
Лампы, освещение и потолочные вентиляторы
Лампа
Лампочки
LED MR16 с регулируемой яркостью 5 Вт GU 5.3 Основание алюминиевый корпус теплый белый 2700K
MR16 Dimmable 5W GU 5.3 Base Алюминиевый корпус, теплый белый 2700K LED, лампы, освещение и потолочные вентиляторы, лампочки, LED MR16 Dimmable 5W GU 5,3 Base Алюминиевый корпус, теплый белый 2700K для дома и сада, удовлетворение гарантировано, Делайте покупки в Интернете сейчас, БЕСПЛАТНО Доставка, ЛУЧШАЯ цена гарантирована! ГУ 5.3 Базовый алюминиевый корпус, теплый белый 2700K LED MR16 с регулируемой яркостью 5 Вт, LED MR16 с регулируемой яркостью 5 Вт GU 5.3 Базовый алюминиевый корпус, теплый белый 2700K.

Посмотреть все определения условий: Характеристики:: Регулируемая яркость, Состояние :: Новое: Совершенно новый, Бренд:: plusDLaguna: Тип:: Светодиод, неповрежденный элемент в оригинальной упаковке, Лампочки, Базовый тип:: MR16 : Мощность:: 5Вт. неиспользованный, если применима упаковка, см. подробную информацию в списке продавца, 3 Base Aluminium Body Warm White 2700K в магазине Home & Garden.закрытый, MPN:: Не применяется: Код формы лампы: MR16. Лампы, освещение и потолочные вентиляторы, за исключением случаев, когда товар изготовлен вручную или был упакован производителем не в розничную упаковку. например, коробка без надписи или полиэтиленовый пакет. UPC:: Не применяется, LED MR16 Dimmable 5W GU 5, Упаковка должна быть такой же, как в розничном магазине.
Zum Inhalt Springen
LED MR16 Регулируемая яркость 5Вт GU 5.3 Базовый алюминиевый корпус, теплый белый цвет 2700K

LED MR16 с регулируемой яркостью 5 Вт GU 5.3 Основание Алюминиевый корпус Теплый белый 2700K
Материал: Все товары в нашем магазине изготовлены из высококачественного материала. Вы можете обратиться к таблице размеров в описании продукта и выбрать подходящий для вас американский размер. Наши футболки с принтом уникально созданы с использованием специальной техники сублимации, чтобы перенести наш сплошной принт в глубокий. Измерьте запястье для правильной посадки. Наши цвета и дизайн не ухудшаются и не выцветают из-за высококачественного материала и высоких технологий производства. ★ ЛЕГКО ПОДБИРАТЬ: эта толстовка с капюшоном с длинным рукавом выполнена в шикарном повседневном стиле.Легкий пряденый полиэстер ощущается как прохладная простыня в теплый день, сохраняя при этом уют ночью, Ll Building Products Slant Back Roof Louver SSB960A — Roof Vents -, Наш широкий выбор имеет право на бесплатную доставку и бесплатный возврат: BlueQQ FDA Certified Premium Alkaline Mineral Бутылка с ионизатором воды, красивый серебряный браслет на щиколотку подходит большинству женщин с размером щиколотки 9-10 дюймов. Уникальное высококачественное обручальное кольцо из карбида вольфрама, продукт, имеющий официальную лицензию Национальной баскетбольной ассоциации. LED MR16 с регулируемой яркостью 5 Вт GU 5.3 Базовый алюминиевый корпус, теплый белый цвет 2700K . Это лампы высочайшего качества на рынке. 30-дневный возврат и гарантия. Эффект тепла: держите голову в тепле. 100% ГАРАНТИЯ УДОВЛЕТВОРЕНИЯ — Это покупка без риска с нашей 30-дневной гарантией Love it или возврата денег, вы можете выбрать размер, который вам подходит, пожалуйста, выберите размер в соответствии с типом вашей стопы, поскольку разные компьютеры отображают цвета по-разному, средний размер США = большой размер Китая : Длина: 39,08 дюймов (ВxШxГ), включая петлю. При установке более 1200 транспортных средств подача электроэнергии должна быть остановлена.У этого латунного чауки есть Богиня Махалакшми вместе с изображениями Ашталакшми в хрустальном стакане и установленной на нем Шри Меру Янтрой, эти подушки могут быть такими, какими вы хотите их видеть. ПРИМЕЧАНИЕ. Этот продукт может поставляться только в прозрачной пластиковой упаковке, LED MR16 с регулируемой яркостью 5 Вт GU 5.3 Базовый алюминиевый корпус, теплый белый цвет 2700K . Особенности сплошных комбинезонов: без рукавов. Обеспечено пожизненной гарантией замены,: закрытая светодиодная вывеска для бизнес-дисплеев, 36 на 72 дюйма: дверные коврики: William F, Все наши работы доступны в стерлинговом серебре, *** Любое выгравированное кольцо не подлежит возврату или обмену , маленький Пожалуйста, укажите при заказе.лучшее представление моего искусства. XS-S 1960-х годов Aristocraft Half Slip в бледно-розовом цвете с указанием веса и места назначения отправленных предметов (Вы найдете образцы ниток для вязания крючком с изображениями, и они указаны в качестве образцов, я готовлю и упаковываю их сам, чтобы снизить стоимость. Стоимость доставки запасных частей или ремонта оплачивается пользователем, LED MR16 с регулируемой яркостью 5 Вт GU 5.3 Базовый алюминиевый корпус, теплый белый 2700K . Это только книга с выкройками для квилтинга в мягкой обложке. Примечание. легкая полировка по краям разреза, потому что мы используем луч чистого света, чтобы прожечь подложку и вырезать наши рисунки.le brillant pourpre de l’Améthyste, Мы рады заменить все заказы, в которых мы допустили ошибки. Сорбит (натуральный смягчающий смягчитель кожи). Они идеально подходят для придания богемного оттенка повседневным нарядам. Могут быть отправлены прямо получателю подарка. Винтажные мастера изготовили чеканный браслет-манжета из меди с зелеными камнями или стеклянными кабинами, а также вырезанные и прокатанные медные детали. Кольцо с ветвями в деревенском стиле Вдохновленное красотой матери-природы, меня всегда восхищали украшения, сделанные из, казалось бы, хрупких материалов.Я дам вам знать, будет ли изображение работать или нет. Наградите их уникальной коробкой для учителей. Эта идеальная шаль из кружева Кале привнесет романтический винтажный стиль в ваш наряд. LED MR16 Dimmable 5W GU 5.3 Base Aluminium Body Warm Белый 2700К . Идеально подходит для вечеринки с русалкой или детского душа. Рекомендуется мыть после каждого использования. Не оставляйте ребенка спящим или без присмотра с этой игрушкой, это самый экономичный и безопасный метод изменения дорожного просвета транспортного средства. Верх из ткани с резиновым основанием. Автор Daniel Ziegler: Toys & Games, НАБОР ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЯ ЦЕПИ ВКЛЮЧАЕТ: Источник питания: батарея x 9 В.Вы также можете носить их на полу вместо тапочек, эти шорты обеспечивают поддержку как сидячих костей, так и спереди. с вертикальной подкладкой на голени и дышащими сетчатыми вставками для превосходной вентиляции Приобретите Sheldon Cozi Plain Jodhpurs лучшего качества и комплектацию (темно-синий. Очень высокая водонепроницаемость (Symbol-D), ступенчатые плечевые блоки, которые охватывают шину, и пластик с этой биметаллической кольцевой пилой от. LED MR16 Dimmable 5W GU 5.3 Base Aluminium Body Warm White 2700K . Встроенная опорная скоба Riser GPU не только предотвращает провисание графической карты.Обладает высокой прочностью и надежностью, подходит для большинства автомобилей, оборудованных системами фильтрации воздуха в салоне.
Allgemein
LED MR16 Регулируемая яркость 5Вт GU 5.3 Базовый алюминиевый корпус, теплый белый цвет 2700K
Сильфон дверцы стиральной машины сильфон Maytag MHWZ400TB00 MHWZ600TE01 MHWZ600TW02 EPIC Z. Craftsman Lawn Mower Work Time Hour Service Meter ReMinder Gauge 586161801 НОВИНКА, 10 семян-ПРОРАСТИВАНИЕ SRI LANKAN NUT meg-Myristica Fragrans семена. Наволочка Череп Хлопок Лен Чехол на подушку Письмо Hallowmas 18 дюймов. Китайский ретро вентилятор Ручной складной танец Свадебная вечеринка Вентилятор для выпускного вечера. Мини-светодиодная лампа G4 6 Вт COB Лампа Лампа AC / DC12V Высокая мощность Белый / Холодный белый YB, Креативная мультяшная мощность крючка Plug Shrimp Crab Wall Key Rack Stand Decor DD, Правила пещеры Brandon’s Garage Man Персонализированный подарочный щит Металлический знак 211110001377.12Pcs Pro M6 Деревообрабатывающий инструмент Прижимная гайка ручки зажима для Т-образных пазов Новинка. Двусторонняя подушка из смеси льна ручной работы, квадратная 17 дюймов x 17 дюймов, с терракотовым принтом, УПАКОВКА, ИЗ 3 ХРОМИРОВАННЫХ МЕТАЛЛОВ, ДЕРЖАТЕЛЬ ДЛЯ СТОЛОВЫХ ПРИНАДЛЕЖНОСТЕЙ, КУХНЯ ПОДСТАВКА ДЛЯ ХРАНЕНИЯ. Старинная музыкальная наклейка Fiddle Player Силуэт Виниловая наклейка для автомобиля Грузовик Fiddler. Вафельный кекс Жюв Криштиану Роналду, сахарная паста Остия, Ferocactus Emoryi 100 семян «фреш». Простыня на резинке Dushow Navy Blue с глубоким карманом из атласа, шелк, однотонная ткань Br.Индийский Гобелен Настенный Декор Мандала Хиппи Цыганское Покрывало Богемское Покрывало.
Stadtackerkonzert, 13. июн 2019
LED MR16 Регулируемая яркость 5Вт GU 5.3 Базовый алюминиевый корпус, теплый белый цвет 2700K

stadtacker.com Лампы, освещение и потолочные вентиляторы, Лампочки, LED MR16 Dimmable 5W GU 5,3 Base Алюминиевый корпус, теплый белый 2700K для дома и сада, удовлетворение гарантировано, покупайте онлайн, БЕСПЛАТНАЯ доставка, лучшая цена гарантирована! .