C5388 параметры: Даташиты (Datasheets C5388) электронных компонентов

Содержание

🛍 Печатающая головка для принтера HP Photosmart 178 364 C5388 C6388 D5468 C309 C310 C410, 5 цветов 1409.67₽

 Добро пожаловать в наш интернет-магазин.

 

 

 

 

5 Цвета 178 364 564 862 Печатающая головка для HP Photosmart 5510 6510 7510 b8558 c5388 c6388 d5468 c309 c310 c410 принтер печатающей головки

 

Параметры:

Название продукта:Заменяемая печатающая головка

Номер картриджа:Для HP364 HP564 HP862 HP178

Печатающая головка модель:Для HP 364 564 862 178

Цвета:BK,PK,C,M,Y -5 цветов

 

Принтер для печати:

Для HP Photosmart 7510 (CQ877B)

Для HP Photosmart B8550(CB981B)

 

Для HP Photosmart C5324 (Q8292B)

 

Для HP Photosmart C5380(Q8291B)

 

Для HP Photosmart C6324 (CD029B)

 

Для HP Photosmart C6380 (CD028B)

 

Для HP Photosmart D5460 (Q8421B)

 

Для HP Photosmart Premium C309a

 

Для HP Photosmart Premium C309n/g(CD743A)

 

Для HP Photosmart Premium C310a(BCN503B1)

 

Для HP Photosmart Premium C410b

 

Для HP Photosmart eStation C510a (CQ140B)

 

Для принтера HP Photosmart Premium e-All-in-One (CN503B)

 

Для принтера HP Photosmart Premium Fax e-All-in-One (CQ521B)

 

Минимальное количество для заказа:2015 г. 1 предмет

Время выполнения заказа:1-2 дня после оплаты

Гарантия:Замена 1:1 для дефектного ite

 

 

 

Добро пожаловать в наш магазин-решения для принтера

«Добавить в мои любимые магазины»

 

— Вы получите самые последние новости обновленных продуктов и цен

 

— Вы получите наши приоритет скидки и купоны

 

 

 

«Добавить в тележки»

 

1. Вы быстро найдете ссылку, когда захотите оплатить;

 

2. Когда цены снижаются, вы получите Примечание;

 

3. Вы можете проверить Отзывы наших продуктов в любое время;

 

 

 

Более интересные самые продаваемые продукты, пожалуйста, нажмите здесь-Наш магазин Самые продаваемые продукты

Если у вас есть вопросы, такие как ваш заказ, счет, купоны, акции, возврат средств, возврат, платежи, условия,

Пожалуйста, нажмите здесь:Покупатель справочный центр

 

 

Примечание:

1.

Пожалуйста, проверьте состояние вашего принтера перед установкой нашего продукта; 2. Выключите принтер, затем установите его шаг за шагом, как наше руководство; 3. Наши цены не включают плату remot ares, мы не отправляем в отдаленные районы, за исключением оплаты дополнительных расходов. 4. Наши цены не включают налоги, пошлины, НДС сборы, таможенные сборы на местном уровне. 5. Пожалуйста, сообщите нам ваш доступный телефон, почту и подробный адрес доставки перед заказом. 6. Любой специальный запрос на отправку счета-фактуры, пожалуйста, свяжитесь с нами бесплатно. Например: Бразилии нужен номер CPF или CNPJ, страна Европы: номер НДС, EORI.

России нужно полное имя получателя.

 

 

Относятся продуктов:

 

 

 

Другие наши горячие продажи относятся к продуктам здесь (пожалуйста, нажмите здесь и откройте ссылку)

 

Для печатающей головки hp 11

 

Для hp 178 5 цветов печатающая головка

 

Для печатающей головки hp 920

 

Для печатающей головки hp 564 4 цвета

 

Для hp 178 4color печатающая головка

 

Для hp cn688a 4 цвета печатающая головка

 

Многоразовый чернильный картридж для hp 934 935 с чипами arc

 

Для hp 564 многоразовый картридж с чипом arc 5 цветов

 

Инструменты для очистки печатающей головки для hp 88/70/940/72/91

 

Для hp 72 многоразовый картридж с чипом arc 130 мл

 

Для hp 970 971 СНПЧ системы с картриджем и arc чипы

 

Для hp 934 935 краситель чернил 100 мл * 4 цвета

 

Для hp 83 UV ink 100 мл * 6 цветов

 

Для hp печатающая головка чистящая жидкость

 

 

 

 

 

Вернитесь на главную страницу!

 

 

 

 

 

 

P.

UA | Чернила WWM для HP Photosmart C5388 3шт x 20мл IR3.HELENA/B | BUY&PRINT

    Набор для Заправки Картриджей WWM совместимый аналог оригинальных чернил HP предназначены для применения в картриджах НР 27, HP 56, HP 21, HP 121, HP 122, HP 129, HP 130, HP 131, HP 132, HP 140.

  Данные Водорастворимые чернила позволяют получать четкие символы и используются для печати текста. Качество отпечатка — максимально приближено к отпечатку полученному при использовании  оригинальных чернил. 

   Производитель чернил WWM — это крупнейшая украинская компания Worldwide Manufacturing, E.D., которая с 1993 года производит продукцию под торговой маркой WWM стабильно Высокого качества для широкого спектра печатающих устройств. При производстве данных чернил используется только высококачественные красители и компоненты. Процесс производства соответствует международным стандартам ISO 9001:2008, ISO 14001:2004, ISO 14024:2002.

   Для успешной работы печатающего устройства, при заправке чернил в картридж, следует соблюдать инструкцию по заправке, которую можно найти на сайте. В процессе заправки не стоит прикасаться руками и сторонними предметами к поверхности чипа картриджей. Чернила Могут быть использованы после прочих совместимых водорастворимых чернил. Помните, попадание чернил на перечисленные элементы картриджа, может негативно отразиться на его работоспособности.

   Количество чернил в емкости 3 x 20г.

  Черные Водорастворимые чернила HELENA B предназначены для картриджей НР 22, HP 110, HP 121, HP 122, HP 134, HP 135, HP 136, HP 141, HP 901 и используются в следующих печатающих устройствах

:

HP Deskjet: 1000 J110A, 1000 J110C, 1000 J110D, 1000 J110E, 1050 AIO J410A, 1050 AIO J410B, 1050 AIO J410C, 1050 AIO J410D, 1050 AIO J410E, 1050A AIO J410A, 1050A AIO J410G, 1050A AIO J410H, 1051A AIO J410F, 1510 AIO, 2000 J210A, 2000 J210B, 2000 J210C, 2050 AIO J510A, 2050 AIO J510C, 2050 AIO J510D, 2050A AIO J510A, 2050A AIO J510C, 2130, 2620, 2630, 3000 J310A, 3050 AIO J610A, 3050 AIO J610B, 3050 AIO J610C, 3050 AIO J610D, 3050 AIO J610E, 3050 AIO J610F, 3050A E-AIO J611B, 3052A E-AIO J611F, 3054A E-AIO J611D, 3320, 3323, 3325, 342, 3420V, 3425, 3520, 3520V, 3520W, 3535, 3550, 3550V, 3550W, 3558, 3620, 3645, 3647, 3650, 3650V, 3653, 3658, 3668, 3740,3745, 3843, 3845, 3845XI, 3847, 3848, 3920, 3940, 450, 450CI, 460, 460WF, 5150, 5150C, 5150V, 5150W, 5420V, 5440, 5440XI, 5442, 5443, 5500, 5550V, 5550W, 5652, 5740XI, 5743,5745, 5748, 5850JP, 5940, 5940XI, 5943, 6520, 6540D, 6540DT, 6540XI, 6543, 6543D, 6545, 6548, 6620, 6620XI, 6623, 6800, 6830, 6840DT, 6840XI, 6843, 6940, 6940DT, 6943, 6980,6980DT, 6983, 9650, 9670, 9680, 9800, 9800D, 9803, 9808, 9808D;

HP Deskjet D: D 1311, D 1320, D 1330, D 1341, D 1360, D 1400, D 1455, D 1460, D 1468, D 1470, D 1560, D 1568, D 1663, D 2360, D 2400, D 2460, D 2563, D 2645, D 2660, D 2663, D 2668, D 2680, D 4163, D 4200, D 4245, D 4263, D 4363

HP Deskjet F: F 2100, F 2110, F 2120, F 2180, F 2187, F 2280, F 2290, F2400, F 2423, F 2480, F 2483, F 2493, F 350, F 375, F 380, F 390, F394, F 4100, F 4180, F 4185, F 4200, F 4213, F 4224, F4275, F 4280, F 4283, F 4480, F 4483, F 4583;

HP Deskjet Ink Advantage: 1015 , 1115 , 1515 AIO , 1516 E-AIO , 2135DN , 2136 , 2515 AIO , 2529 , 2545 AIO , 2645 E-AIO , 3515 E-AIO , 3545 , 3635 , 3775 , 3785 , 3835 , 4515 , 4535 , 4645 E-AIO , 4675 , 4729 , 5075;

HP Deskjet Ultra Ink Advantage: 2020HC, 2029, 2520HC;

HP Officejet: 100 L410a, 4312, 4314, 4315, 4317, 4319, 4355, 4500 G510a, 4500 G510g, 4500 G510n, 5605, 5607, 5610, 5610v, 5610xi, 5615, 6200, 6203, 6205, 6210v, 6210xi, 6213, 6215, 6304, 6307, 6308, 6310v, 6310xi, 6313, 6318, 7205, 7208, 7210v, 7210xi, 7213, 7215, 7310, 7310xi, 7313, 7408, 7413;

HP Officejet J: J 3680, J 4524, J 4580, J 4624, J 4660, J 4680, J 5783, J 6410, J 6413, J 6424;

HP Officejet K: K 7100, K 7103, K 7108;

HP  PSC: 1503, 1504, 1506, 1507, 1508, 1510v, 1510xi, 1513, 1513s, 1514, 1600, 1603, 1605, 1610v, 1610xi, 1613, 1615, 2352, 2353, 2355p, 2355v, 2355xi, 2357, 2358;

HP Photosmart: 2570, 2571, 2575v, 2577, 2578, 2608, 2610v, 2610xi, 2710v, 2710xi, 325, 325v, 325xi, 329, 335, 335v, 335xi, 337, 375, 375b, 375v, 375xi, 385, 385v, 385xi, 422, 422v, 422xi, 425, 425v, 428v, 428xi, 475v, 475xi, 7838, 7850, 8030, 8038, 8049, 8050v, 8053, 8150, 8150w, 8153, 8157, 8450, 8450v, 8450w, 8453, 8750, 8750gp, 8750xi, 8753, 8758;

HP Photosmart A: A 310, A 314, A 320, A 432, A 433, A 436, A 440, A 441, A 444, A 510, A 516, A 520, A 526, A 532, A 610, A 612, A 618, A 626, A 640, A 646, A 717, A 820, A 826;

HP Photosmart C:  C 3125, C 3170, C 3183, C 3190, C 3194, C 4110, C 4140, C 4150, C 4170, C 4173, C 4180, C 4183, C 4190, C 4193, C 4194, C 4273, C 4283, C 4300, C 4340, C 4343, C 4385, C 4388, C 4424, C 4435, C 4440, C 4450, C 4472, C 4473, C 4480, C 4483, C 4485, C 4524, C 4580, C 4583, C 4588, C 4599, C 4683, C 4783, C 4793, C 4795, C 5200, C 5280, C 5283, C 5580;

HP Photosmart D: D 5060, D 5063, D 5163, D 5345, D 5363, Pro B 8350;

Мобильные очистные сооружения Alta Air Master

Мобильная станция глубокой биохимической очистки хозяйственно-бытовых и промышленных сточных вод Alta Air Master 6 (mobile) и Alta Air Master 10 (mobile) (далее станция), это модульные наземные локальные очистные сооружения производительностью 6 и 10м3 в сутки.

Станция поставляется готовым, полностью укомплектованным и готовым к установке модулем.

Вместе со Станциями дополнительно могут быть поставлены мобильные модули с различным хозяйственно-бытовым оборудованием, таким как туалеты, душевые кабинки, рукомойники.

 

 

Сочетание биологической и химической очистки позволяет получать гарантированные результаты по большому количеству параметров, а так же значительно сократить размеры и стоимость очистных сооружений. Конструкция Станции рассчитана на неравномерное поступление сточных вод в течение суток с двукратным коэффициентом среднесуточной неравномерности.

Обслуживание Станции не соизмеримо дешевле обслуживания биотуалетов – откачка Станции при постоянном использовании на максимальной производительности осуществляется не чаще одного раза в год. Стоимость оборудования окупается для заказчика на экономии в обслуживании, в усредненных условиях за три месяца.

Очищенную на Станции воду при определенных условиях можно использовать в технических целях на стройке.

Станции Alta Air Master 6 (mobile) и Alta Air Master 10 (mobile) нашли свое широкое применение как временное очистное сооружение с гарантированной очисткой стока до показателей, разрешенных к сбросу очищенной воды на грунт, в ливневые и дренажные системы, а при обеспечении дополнительного УФ обеззараживания воды в водоем:

  • на строительных площадках и вахтовых временных поселках, где необходимо организовать временный хозяйственно-бытовой узел;
  • при обеспечении очистки стока для постоянных абонентов на период строительства и ввода в эксплуатацию постоянных сетей или очистных сооружений;
  • при проведении массовых мероприятий;
  • для летних кафе, ресторанов и тп;
  • в местах где запрещено устанавливать оборудование в землю – заповедники и заказники, парки отдыха и тд.

А так же, как постоянные системы очистки в местах, где затруднительно смонтировать оборудование в землю, северные регионы в условиях вечной мерзлоты, в условиях скальных грунтов либо крайне неустойчивых грунтах.

Для оповещения и дистанционного управления работой очистных сооружений и для своевременного предупреждения аварийных ситуаций, станцию возможно оборудовать системой SMS оповещения и дистанционного управления работой очистных сооружений Alta Contact (поставляется опционально). Система Alta Contact осуществляет контроль наличия внешнего электропитания, наличия химикатов, контроль температурного режима, оповещает о необходимости откачки осадка, осуществляет защиту отсека оборудования от протечки и затопления.

Система Alta Contact осуществляет дистанционное управление электропитанием системы, включение/отключение аварийного и резервного насосов, включение/отключение звуковой/световой сигнализации. Управляющая автоматика Станции и компрессорное оборудование располагаются в отапливаемом вентилируемом технологическом помещении Станции, крайне важно при использовании Станции в условиях севера, воздух для аэрации стока забирается не с улицы, а оптимальной температуры из помещения.

Станция не требует обязательного оборудования поля поглощения или поля фильтрации, сброс очищенной воды может быть организован непосредственно на грунт, в дренажные и ливневые системы, а при оборудовании станции блоком УФ обеззараживания Alta BioClean в водоемы рыбохозяйственного назначения. Периодичность обслуживания один — четыре раза в год.

Универсальный сантехнический модуль оборудован нагревательным баком для воды, двумя рукомойниками, электрическим конвектором для обогрева помещения, необходимым и достаточным освещением, а так же четырьмя сантехническими точками, это могут быть унитазы или душ в различном соотношении.

 

В базовой комплектации Универсальный сантехнический модуль оборудован подводящим патрубком для обеспечения водоснабжения, дополнительно модуль может быть оборудован накопительным баком как внутреннего так и наружного размещения, различного объема в зависимости от основного функционала и сезонности использования.


 

 


 

 

Транзистор 2SC5388 NPN 1500/1700V 5A 50W в>100 TO-3PML

Модел: 2SC5388
Тип: биполярен, NPN
Време на спадане на импулса/бързодействие/: 800 ns
Максимално напрежение колектор-емитер: 700 V
Максимално напрежение емитер-база: 5 V
Максимално напрежение колектор-база: 1500 V
Максимален колекторен ток: 5 A
Обратен колекторен ток: 0.1 mA
Мощност: 50 W
Максимална работна температура: 150°C
Корпус: TO-3PML
Монтаж: THT

Технически параметри на Транзистор 2SC5388, NPN, 1500 V, 5 A, 50 W, TO3PML

Тип транзистор:

Максимално напрежение колектор-емитер Uceo:

Максимален колекторен ток Ic:

Максимално напрежение колектор-база Ucbo:

Работна температура:

Техническа документация на Транзистор 2SC5388, NPN, 1500 V, 5 A, 50 W, TO3PML

C5388 — Транзистор, 2SC5388 — DataSheetGo.

com

Номер детали: C5388

Функции: 2SC5388, это полупроводник.

Производитель: Sanyo Semicon Device

Изображение :

Тексты в файле PDF:

Номер заказа: ENN6283 Тройной диффузионный планарный кремниевый транзистор NPN 2SC5388 Коммутация высокого напряжения

Характеристики

· Высокая скорость (принятие процесса MBIT).· Высокое напряжение пробоя (ВКН=1500В). · Высокая надежность (принятие процесса HVP). · Встроенный демпферный диод. Размеры корпуса Единица измерения: мм 2039D [2SC5388] 3,4 16,0 5,6 3,1 5,0 8,0 21,0 22,0 20,4 2,8 2,0 1,0 4,0 2,0 0,6 1 2 3 Коллектор напряжения эмиттер-база Ток коллектора тока (импульсный) Коллектор тока базы Температура рассеивания Температура перехода Температура хранения Обозначение VCBO VCEO VEBO IC ICP IB PC Tj Tstg Tc=25˚C 5.45 Условия 3,5 5,45 2,0 1 : База 2 : Коллектор 3 : Эмиттер SANYO : TO-3PML Номинальные параметры 1500 700 5 5 10 1 3,0 50 150 от –55 до +150 Блок VVVAAAWW ˚C ˚C Электрические характеристики при Ta = 25˚C Параметр Коллектор Ток отсечки Ток отсечки эмиттера Коэффициент усиления постоянного тока Обозначение ICBO IEBO hFE1 hFE2 VCB=700 В, IE=0 VEB=5 В, IC=0 VCE=5 В, IC=1 A VCE=5 В, IC=5 A 100 50 Условия Номинальные параметры мин. тип. макс. 0,1 600 230 150 Единица измерения мА мА Продолжение на следующей странице. Любая без исключения продукция SANYO, описанная или содержащаяся в данном документе, не имеет спецификаций, позволяющих работать с приложениями, требующими чрезвычайно высокого уровня надежности, такими как системы жизнеобеспечения, системы управления самолетами или другие приложения, отказ которых, как можно разумно ожидать, приведет к серьезным физическим повреждениям. и/или материальный ущерб.Проконсультируйтесь с ближайшим к вам представителем SANYO, прежде чем использовать какие-либо продукты SANYO, описанные или содержащиеся в настоящем документе, в таких приложениях. SANYO не несет ответственности за отказы оборудования в результате использования продуктов со значениями, даже кратковременно превышающими номинальные значения (такие как максимальные номинальные значения, диапазоны рабочих условий или другие параметры), указанные в технических характеристиках любых без исключения продуктов SANYO, описанных или содержащихся в настоящем документе. . SANYO Electric Co. [ … ]

C5388 PDF-файл

Ошибка 404 — Страница не найдена

Страна COUNTRYAfghanistanÅland IslandsAlbaniaAlgeriaAmerican SamoaAndorraAngolaAnguillaAntigua и BarbudaArgentinaArmeniaArubaAustraliaAustriaAzerbaijanBahamasBahrainBangladeshBarbadosBelarusBelgiumBelizeBeninBermudaBhutanBoliviaBosnia и HerzegovinaBotswanaBouvet IslandBrazilBritish Индийский океан TerritoryBruneiBulgariaBurkina FasoBurundiCambodiaCameroonCanadaCape VerdeCaribbean NetherlandsCayman IslandsChadChileChinaChristmas IslandCocos IslandsColombiaComorosCongo, Демократическая RepublicCook IslandsCosta RicaCroatiaCubaCuraçaoCyprusCzech RepublicDenmarkDjiboutiDominicaDominican RepublicEast TimorEcuadorEgyptEl SalvadorEquatorial GuineaEritreaEstoniaEthiopiaFalkland IslandsFaroe IslandsFijiFinlandFranceFrench GuianaFrench PolynesiaFrench Южный TerritoriesGabonGambiaGeorgiaGermanyGhanaGibraltarGreeceGreenlandGrenadaGuadeloupeGuamGuatemalaGuernseyGuineaGuinea-BissauGuyanaHaitiHondurasHong KongHungaryIcelandIndiaIndonesiaIranIraqIrelandIsle из ManIsraelItalyIvory CoastJamaicaJapanJerseyJordan KazakhstanKenyaKiribatiKosovoKuwaitKyrgyzstanLaosLatviaLebanonLesothoLiberiaLibyaLiechtensteinLithuaniaLuxembourgMacaoMacedoniaMadagascarMalawiMalaysiaMaldivesMaliMaltaMarshall IslandsMartiniqueMauritaniaMauritiusMayotteMexicoMicronesiaMoldovaMonacoMongoliaMontenegroMontserratMoroccoMozambiqueMyanmarNamibiaNauruNepalNetherlandsNew CaledoniaNew ZealandNicaraguaNigerNigeriaNiueNorfork IslandNorwayOmanPakistanPalauPalestinian TerritoryPanamaPapua Новый GuineaParaguayPeruPhilippinesPitcairn IslandPolandPortugalPuerto RicoQatarRepublic из CongoReunionRomaniaRussiaRwandaSaint HelenaSaint Киттс и NevisSaint LuciaSaint Пьер и MiquelonSaint Винсент и GrenadinesSamoaSan MarinoSao Томе и PrincipeSaudi ArabiaSenegalSerbiaSeychellesSierra LeoneSingaporeSint MaartenSlovakiaSloveniaSolomon IslandsSomaliaSouth AfricaSouth Грузии и Южные Сандвичевы IslandsSouth KoreaSouth SudanSpainSri LankaSudanSurinameSvalbard и Ян MayenSwazilandSwedenSwitzerlandSyriaTaiwanTajikistanTanzaniaThaila ндТогоТокелауТонгаТринидад и ТобагоТунисТурцияТуркменистанОстрова Теркс и КайкосТувалуУгандаУкраинаОбъединенные Арабские ЭмиратыВеликобританияСоединенные ШтатыОтдаленные малые острова СШАУругвайУзбекистанВануатуВатиканВенесуэлаВьетнамВиргинские острова, Британские Виргинские острова, СШАЗападная СахараЙеменЗамбияЗимбабве

Конгресс.

правительство | Библиотека Конгресса

Раздел протокола Конгресса Ежедневный дайджест Сенат жилой дом Расширения замечаний

Замечания участников Автор Any House MemberАдамс, Алма С.[D-NC] Адерхольт, Роберт Б. [R-AL] Агилар, Пит [D-CA] Аллен, Рик В. [R-GA] Оллред, Колин З. [D-TX] Амодеи, Марк Э. [R -NV] Армстронг, Келли [R-ND] Аррингтон, Джоди С. [R-TX] Окинклосс, Джейк [D-MA] Эксн, Синтия [D-IA] Бабин, Брайан [R-TX] Бэкон, Дон [R -NE] Бэрд, Джеймс Р. [R-IN] Балдерсон, Трой [R-OH] Бэнкс, Джим [R-IN] Барр, Энди [R-KY] Барраган, Нанетт Диаз [D-CA] Басс, Карен [ D-CA] Битти, Джойс [D-OH] Бенц, Клифф [R-OR] Бера, Ами [D-CA] Бергман, Джек [R-MI] Бейер, Дональд С. -младший [D-VA] Байс , Стефани И. [R-OK] Биггс, Энди [R-AZ] Билиракис, Гас М.[R-FL] Бишоп, Дэн [R-NC] Бишоп, Сэнфорд Д., младший [D-GA] Блюменауэр, Эрл [D-OR] Блант Рочестер, Лиза [D-DE] Боберт, Лорен [R-CO ] Бонамичи, Сюзанна [D-OR] Бост, Майк [R-IL] Бурдо, Кэролайн [D-GA] Боуман, Джамаал [D-NY] Бойл, Брендан Ф. [D-PA] Брэди, Кевин [R-TX ] Брукс, Мо [R-AL] Браун, Энтони Г. [D-MD] Браун, Шонтел М. [D-OH] Браунли, Джулия [D-CA] Бьюкенен, Верн [R-FL] Бак, Кен [R -CO] Бакшон, Ларри [R-IN] Бадд, Тед [R-NC] Берчетт, Тим [R-TN] Берджесс, Майкл С. [R-TX] Буш, Кори [D-MO] Бустос, Чери [D -ИЛ] Баттерфилд, Г.К. [D-NC] Калверт, Кен [R-CA] Каммак, Кэт [R-FL] Карбахал, Салуд О. [D-CA] Карденас, Тони [D-CA] Кэри, Майк [R-OH] Карл , Джерри Л. [R-AL] Карсон, Андре [D-IN] Картер, Эрл Л. «Бадди» [R-GA] Картер, Джон Р. [R-TX] Картер, Трой [D-LA] Картрайт, Мэтт [D-PA] Кейс, Эд [D-HI] Кастен, Шон [D-IL] Кастор, Кэти [D-FL] Кастро, Хоакин [D-TX] Коуторн, Мэдисон [R-NC] Шабо, Стив [ R-OH] Чейни, Лиз [R-WY] Черфилус-МакКормик, Шейла [D-FL] Чу, Джуди [D-CA] Чичиллин, Дэвид Н. [D-RI] Кларк, Кэтрин М. [D-MA] Кларк, Иветт Д.[D-NY] Кливер, Эмануэль [D-MO] Клайн, Бен [R-VA] Клауд, Майкл [R-TX] Клайберн, Джеймс Э. [D-SC] Клайд, Эндрю С. [R-GA] Коэн , Стив [D-TN] Коул, Том [R-OK] Комер, Джеймс [R-KY] Коннолли, Джеральд Э. [D-VA] Купер, Джим [D-TN] Корреа, Дж. Луис [D-CA ] Коста, Джим [D-CA] Кортни, Джо [D-CT] Крейг, Энджи [D-MN] Кроуфорд, Эрик А. «Рик» [R-AR] Креншоу, Дэн [R-TX] Крист, Чарли [ D-FL] Кроу, Джейсон [D-CO] Куэльяр, Генри [D-TX] Кертис, Джон Р. [R-UT] Дэвидс, Шарис [D-KS] Дэвидсон, Уоррен [R-OH] Дэвис, Дэнни К. [D-IL] Дэвис, Родни [R-IL] Дин, Мадлен [D-PA] ДеФацио, Питер А.[D-OR] ДеГетт, Диана [D-CO] ДеЛауро, Роза Л. [D-CT] ДельБен, Сьюзан К. [D-WA] Дельгадо, Антонио [D-NY] Демингс, Вэл Батлер [D-FL] ДеСольнье, Марк [D-CA] ДеЖарле, Скотт [R-TN] Дойч, Теодор Э. [D-FL] Диас-Баларт, Марио [R-FL] Дингелл, Дебби [D-MI] Доггетт, Ллойд [D- TX] Дональдс, Байрон [R-FL] Дойл, Майкл Ф. [D-PA] Дункан, Джефф [R-SC] Данн, Нил П. [R-FL] Эллзи, Джейк [R-TX] Эммер, Том [ R-MN] Эскобар, Вероника [D-TX] Эшу, Анна Г. [D-CA] Эспайлат, Адриано [D-NY] Эстес, Рон [R-KS] Эванс, Дуайт [D-PA] Фэллон, Пэт [ R-TX] Финстра, Рэнди [R-IA] Фергюсон, А.Дрю, IV [R-GA] Фишбах, Мишель [R-MN] Фицджеральд, Скотт [R-WI] Фицпатрик, Брайан К. [R-PA] Флейшманн, Чарльз Дж. «Чак» [R-TN] Флетчер, Лиззи [D-TX] Фортенберри, Джефф [R-NE] Фостер, Билл [D-IL] Фокс, Вирджиния [R-NC] Франкель, Лоис [D-FL] Франклин, К. Скотт [R-FL] Фадж, Марсия Л. [D-OH] Фулчер, Расс [R-ID] Гаетц, Мэтт [R-FL] Галлахер, Майк [R-WI] Галлего, Рубен [D-AZ] Гараменди, Джон [D-CA] Гарбарино, Эндрю Р. [R-NY] Гарсия, Хесус Г. «Чуй» [D-IL] Гарсия, Майк [R-CA] Гарсия, Сильвия Р. [D-TX] Гиббс, Боб [R-OH] Хименес, Карлос А. .[R-FL] Гомерт, Луи [R-TX] Голден, Джаред Ф. [D-ME] Гомес, Джимми [D-CA] Гонсалес, Тони [R-TX] Гонсалес, Энтони [R-OH] Гонсалес, Висенте [D-TX] Гонсалес-Колон, Дженниффер [R-PR] Гуд, Боб [R-VA] Гуден, Лэнс [R-TX] Госар, Пол А. [R-AZ] Готхаймер, Джош [D-NJ] Грейнджер , Кей [R-TX] Грейвс, Гаррет [R-LA] Грейвс, Сэм [R-MO] Грин, Эл [D-TX] Грин, Марк Э. [R-TN] Грин, Марджори Тейлор [R-GA] Гриффит, Х. Морган [R-VA] Грихальва, Рауль М. [D-AZ] Гротман, Гленн [R-WI] Гест, Майкл [R-MS] Гатри, Бретт [R-KY] Хааланд, Дебра А.[D-NM] Хагедорн, Джим [R-MN] Хардер, Джош [D-CA] Харрис, Энди [R-MD] Харшбаргер, Диана [R-TN] Харцлер, Вики [R-MO] Гастингс, Элси Л. [D-FL] Хейс, Джахана [D-CT] Херн, Кевин [R-OK] Херрелл, Иветт [R-NM] Эррера Бейтлер, Хайме [R-WA] Хайс, Джоди Б. [R-GA] Хиггинс, Брайан [D-NY] Хиггинс, Клэй [R-LA] Хилл, Дж. Френч [R-AR] Хаймс, Джеймс А. [D-CT] Хинсон, Эшли [R-IA] Холлингсворт, Трей [R-IN] Хорсфорд, Стивен [D-NV] Хулахан, Крисси [D-PA] Хойер, Стени Х. [D-MD] Хадсон, Ричард [R-NC] Хаффман, Джаред [D-CA] Хьюзенга, Билл [R-MI] Исса, Даррелл Э.[R-CA] Джексон Ли, Шейла [D-TX] Джексон, Ронни [R-TX] Джейкобс, Крис [R-NY] Джейкобс, Сара [D-CA] Джаяпал, Прамила [D-WA] Джеффрис, Хаким С. [D-NY] Джонсон, Билл [R-OH] Джонсон, Дасти [R-SD] Джонсон, Эдди Бернис [D-TX] Джонсон, Генри С. «Хэнк» младший [D-GA] Джонсон, Майк [R-LA] Джонс, Мондер [D-NY] Джордан, Джим [R-OH] Джойс, Дэвид П. [R-OH] Джойс, Джон [R-PA] Кахеле, Кайалии [D-HI] Каптур , Марси [D-OH] Катко, Джон [R-NY] Китинг, Уильям Р. [D-MA] Келлер, Фред [R-PA] Келли, Майк [R-PA] Келли, Робин Л. [D-IL ] Келли, Трент [R-MS] Ханна, Ро [D-CA] Килди, Дэниел Т.[D-MI]Килмер, Дерек [D-WA]Ким, Энди [D-NJ]Ким, Янг [R-CA]Кинд, Рон [D-WI]Кинзингер, Адам [R-IL]Киркпатрик, Энн [D -AZ] Кришнамурти, Раджа [D-IL] Кастер, Энн М. [D-NH] Кустофф, Дэвид [R-TN] ЛаХуд, Дарин [R-IL] ЛаМальфа, Дуг [R-CA] Лэмб, Конор [D -PA] Ламборн, Дуг [R-CO] Ланжевен, Джеймс Р. [D-RI] Ларсен, Рик [D-WA] Ларсон, Джон Б. [D-CT] Латта, Роберт Э. [R-OH] ЛаТернер , Джейк [R-KS] Лоуренс, Бренда Л. [D-MI] Лоусон, Эл, младший [D-FL] Ли, Барбара [D-CA] Ли, Сьюзи [D-NV] Леже Фернандес, Тереза ​​[D -NM] Леско, Дебби [R-AZ] Летлоу, Джулия [R-LA] Левин, Энди [D-MI] Левин, Майк [D-CA] Лью, Тед [D-CA] Лофгрен, Зои [D-CA] ] Лонг, Билли [R-MO] Лоудермилк, Барри [R-GA] Ловенталь, Алан С.[D-CA] Лукас, Фрэнк Д. [R-OK] Люткемейер, Блейн [R-MO] Лурия, Элейн Г. [D-VA] Линч, Стивен Ф. [D-MA] Мейс, Нэнси [R-SC ] Малиновски, Том [D-NJ] Маллиотакис, Николь [R-NY] Мэлони, Кэролин Б. [D-NY] Мэлони, Шон Патрик [D-NY] Манн, Трейси [R-KS] Мэннинг, Кэти Э. [ D-NC] Мэсси, Томас [R-KY] Маст, Брайан Дж. [R-FL] Мацуи, Дорис О. [D-CA] МакБат, Люси [D-GA] Маккарти, Кевин [R-CA] Маккол, Майкл Т. [R-TX] Макклейн, Лиза К. [R-MI] МакКлинток, Том [R-CA] МакКоллум, Бетти [D-MN] МакИчин, А. Дональд [D-VA] Макговерн, Джеймс П.[D-MA] МакГенри, Патрик Т. [R-NC] МакКинли, Дэвид Б. [R-WV] МакМоррис Роджерс, Кэти [R-WA] МакНерни, Джерри [D-CA] Микс, Грегори В. [D- Нью-Йорк] Мейер, Питер [R-MI] Менг, Грейс [D-NY] Мейзер, Дэниел [R-PA] Мфуме, Квейси [D-MD] Миллер, Кэрол Д. [R-WV] Миллер, Мэри Э. [ R-IL] Миллер-Микс, Марианнетт [R-IA] Муленаар, Джон Р. [R-MI] Муни, Александр X. [R-WV] Мур, Барри [R-AL] Мур, Блейк Д. [R- UT] Мур, Гвен [D-WI] Морелл, Джозеф Д. [D-NY] Моултон, Сет [D-MA] Мрван, Фрэнк Дж. [D-IN] Маллин, Маркуэйн [R-OK] Мерфи, Грегори [ R-NC] Мерфи, Стефани Н.[D-FL] Надлер, Джеррольд [D-NY] Наполитано, Грейс Ф. [D-CA] Нил, Ричард Э. [D-MA] Негус, Джо [D-CO] Нельс, Трой Э. [R-TX ] Ньюхаус, Дэн [R-WA] Ньюман, Мари [D-IL] Норкросс, Дональд [D-NJ] Норман, Ральф [R-SC] Нортон, Элеонора Холмс [D-DC] Нуньес, Девин [R-CA] О’Халлеран, Том [D-AZ] Обернольте, Джей [R-CA] Окасио-Кортес, Александрия [D-NY] Омар, Ильхан [D-MN] Оуэнс, Берджесс [R-UT] Палаццо, Стивен М. [ R-MS] Паллоне, Фрэнк-младший [D-NJ] Палмер, Гэри Дж. [R-AL] Панетта, Джимми [D-CA] Паппас, Крис [D-NH] Паскрелл, Билл-младший [D- Нью-Джерси] Пейн, Дональд М., младший [D-NJ] Пелоси, Нэнси [D-CA] Пенс, Грег [R-IN] Перлмуттер, Эд [D-CO] Перри, Скотт [R-PA] Питерс, Скотт Х. [D-CA] Пфлюгер, Август [R-TX] Филлипс, Дин [D-MN] Пингри, Челли [D-ME] Пласкетт, Стейси Э. [D-VI] Покан, Марк [D-WI] Портер, Кэти [D-CA] Поузи, Билл [R-FL] Прессли, Аянна [D-MA] Прайс, Дэвид Э. [D-NC] Куигли, Майк [D-IL] Радеваген, Аумуа Амата Коулман [R-AS] Раскин, Джейми [D- MD] Рид, Том [R-NY] Решенталер, Гай [R-PA] Райс, Кэтлин М. [D-NY] Райс, Том [R-SC] Ричмонд, Седрик Л. [D-LA] Роджерс, Гарольд [ R-KY] Роджерс, Майк Д.[R-AL] Роуз, Джон В. [R-TN] Розендейл-старший, Мэтью М. [R-MT] Росс, Дебора К. [D-NC] Роузер, Дэвид [R-NC] Рой, Чип [R -TX] Ройбал-Аллард, Люсиль [D-CA]Руис, Рауль [D-CA]Рупперсбергер, CA Датч [D-MD]Раш, Бобби Л. [D-IL]Резерфорд, Джон Х. [R-FL] Райан, Тим [D-OH] Саблан, Грегорио Килили Камачо [D-MP] Салазар, Мария Эльвира [R-FL] Сан-Николас, Майкл FQ [D-GU] Санчес, Линда Т. [D-CA] Сарбейнс, Джон П. [D-MD] Скализ, Стив [R-LA] Скэнлон, Мэри Гей [D-PA] Шаковски, Дженис Д. [D-IL] Шифф, Адам Б. [D-CA] Шнайдер, Брэдли Скотт [D -IL] Шредер, Курт [D-OR] Шриер, Ким [D-WA] Швайкерт, Дэвид [R-AZ] Скотт, Остин [R-GA] Скотт, Дэвид [D-GA] Скотт, Роберт С.«Бобби» [D-VA] Сешнс, Пит [R-TX] Сьюэлл, Терри А. [D-AL] Шерман, Брэд [D-CA] Шеррилл, Мики [D-NJ] Симпсон, Майкл К. [R- ID] Сиры, Альбио [D-NJ] Слоткин, Элисса [D-MI] Смит, Адам [D-WA] Смит, Адриан [R-NE] Смит, Кристофер Х. [R-NJ] Смит, Джейсон [R- MO] Смакер, Ллойд [R-PA] Сото, Даррен [D-FL] Спанбергер, Эбигейл Дэвис [D-VA] Спартц, Виктория [R-IN] Спейер, Джеки [D-CA] Стэнсбери, Мелани Энн [D- NM] Стэнтон, Грег [D-AZ] Штаубер, Пит [R-MN] Стил, Мишель [R-CA] Стефаник, Элиз М. [R-NY] Стайл, Брайан [R-WI] Штойбе, В.Грегори [R-FL] Стивенс, Хейли М. [D-MI] Стюарт, Крис [R-UT] Стиверс, Стив [R-OH] Стрикленд, Мэрилин [D-WA] Суоцци, Томас Р. [D-NY] Суолвелл, Эрик [D-CA] Такано, Марк [D-CA] Тейлор, Ван [R-TX] Тенни, Клаудия [R-NY] Томпсон, Бенни Г. [D-MS] Томпсон, Гленн [R-PA] Томпсон, Майк [D-CA] Тиффани, Томас П. [R-WI] Тиммонс, Уильям Р. IV [R-SC] Титус, Дина [D-NV] Тлайб, Рашида [D-MI] Тонко, Пол [D -NY] Торрес, Норма Дж. [D-CA] Торрес, Ричи [D-NY] Трэхан, Лори [D-MA] Троун, Дэвид Дж. [D-MD] Тернер, Майкл Р. [R-OH] Андервуд , Лорен [D-IL] Аптон, Фред [R-MI] Валадао, Дэвид Г.[R-CA] Ван Дрю, Джефферсон [R-NJ] Ван Дайн, Бет [R-TX] Варгас, Хуан [D-CA] Визи, Марк А. [D-TX] Вела, Филемон [D-TX] Веласкес , Нидия М. [D-NY] Вагнер, Энн [R-MO] Уолберг, Тим [R-MI] Валорски, Джеки [R-IN] Вальц, Майкл [R-FL] Вассерман Шульц, Дебби [D-FL] Уотерс, Максин [D-CA] Уотсон Коулман, Бонни [D-NJ] Вебер, Рэнди К. старший [R-TX] Вебстер, Дэниел [R-FL] Уэлч, Питер [D-VT] Венструп, Брэд Р. [R-OH] Вестерман, Брюс [R-AR] Векстон, Дженнифер [D-VA] Уайлд, Сьюзен [D-PA] Уильямс, Никема [D-GA] Уильямс, Роджер [R-TX] Уилсон, Фредерика С. .[D-FL] Уилсон, Джо [R-SC] Виттман, Роберт Дж. [R-VA] Вомак, Стив [R-AR] Райт, Рон [R-TX] Ярмут, Джон А. [D-KY] Янг , Дон [R-AK] Зелдин, Ли М. [R-NY] Любой член Сената Болдуин, Тэмми [D-WI] Баррассо, Джон [R-WY] Беннет, Майкл Ф. [D-CO] Блэкберн, Марша [ R-TN] Блюменталь, Ричард [D-CT] Блант, Рой [R-MO] Букер, Кори А. [D-NJ] Бузман, Джон [R-AR] Браун, Майк [R-IN] Браун, Шеррод [ D-OH] Берр, Ричард [R-NC] Кантвелл, Мария [D-WA] Капито, Шелли Мур [R-WV] Кардин, Бенджамин Л. [D-MD] Карпер, Томас Р. [D-DE] Кейси , Роберт П., младший [D-PA] Кэссиди, Билл [R-LA] Коллинз, Сьюзен М. [R-ME] Кунс, Кристофер А. [D-DE] Корнин, Джон [R-TX] Кортес Масто, Кэтрин [D -NV] Коттон, Том [R-AR] Крамер, Кевин [R-ND] Крапо, Майк [R-ID] Круз, Тед [R-TX] Дейнс, Стив [R-MT] Дакворт, Тэмми [D-IL ] Дурбин, Ричард Дж. [D-IL] Эрнст, Джони [R-IA] Файнштейн, Дайэнн [D-CA] Фишер, Деб [R-NE] Гиллибранд, Кирстен Э. [D-NY] Грэм, Линдси [R -SC] Грассли, Чак [R-IA] Хагерти, Билл [R-TN] Харрис, Камала Д. [D-CA] Хассан, Маргарет Вуд [D-NH] Хоули, Джош [R-MO] Генрих, Мартин [ D-NM] Хикенлупер, Джон У.[D-CO] Хироно, Мэйзи К. [D-HI] Хувен, Джон [R-ND] Хайд-Смит, Синди [R-MS] Инхоф, Джеймс М. [R-OK] Джонсон, Рон [R-WI ] Кейн, Тим [D-VA] Келли, Марк [D-AZ] Кеннеди, Джон [R-LA] Кинг, Ангус С.-младший [I-ME] Клобучар, Эми [D-MN] Лэнкфорд, Джеймс [ R-OK] Лихи, Патрик Дж. [D-VT] Ли, Майк [R-UT] Леффлер, Келли [R-GA] Лухан, Бен Рэй [D-NM] Ламмис, Синтия М. [R-WY] Манчин , Джо, III [D-WV] Марки, Эдвард Дж. [D-MA] Маршалл, Роджер [R-KS] МакКоннелл, Митч [R-KY] Менендес, Роберт [D-NJ] Меркли, Джефф [D-OR ] Моран, Джерри [R-KS] Мурковски, Лиза [R-AK] Мерфи, Кристофер [D-CT] Мюррей, Пэтти [D-WA] Оссофф, Джон [D-GA] Падилья, Алекс [D-CA] Пол , Рэнд [R-KY] Питерс, Гэри С.[D-MI] Портман, Роб [R-OH] Рид, Джек [D-RI] Риш, Джеймс Э. [R-ID] Ромни, Митт [R-UT] Розен, Джеки [D-NV] Раундс, Майк [R-SD] Рубио, Марко [R-FL] Сандерс, Бернард [I-VT] Сассе, Бен [R-NE] Шац, Брайан [D-HI] Шумер, Чарльз Э. [D-NY] Скотт, Рик [R-FL] Скотт, Тим [R-SC] Шахин, Жанна [D-NH] Шелби, Ричард С. [R-AL] Синема, Кирстен [D-AZ] Смит, Тина [D-MN] Стабеноу, Дебби [D-MI] Салливан, Дэн [R-AK] Тестер, Джон [D-MT] Тьюн, Джон [R-SD] Тиллис, Томас [R-NC] Туми, Патрик [R-PA] Тубервиль, Томми [R -AL] Ван Холлен, Крис [D-MD] Уорнер, Марк Р.[D-VA] Уорнок, Рафаэль Г. [D-GA] Уоррен, Элизабет [D-MA] Уайтхаус, Шелдон [D-RI] Уикер, Роджер Ф. [R-MS] Уайден, Рон [D-OR] Янг , Тодд [R-IN]

73937749

%PDF-1.7 % 1 0 объект >/Metadata 5 0 R/Outlines 2 0 R/PageLayout/OneColumn/Pages 3 0 R/StructTreeRoot 4 0 R/Type/Catalog>> эндообъект 5 0 объект >поток 2022-03-03T17:37:10-08:002021-03-05T23:16:34-08:002022-03-03T17:37:10-08:00Заявитель AppendPDF Pro 5.5uuid:93033914-b0b4-11b2-0a00- 782dad000000uuid:54decd7e-1dd2-11b2-0a00-1e003835ffffapplication/pdf

  • 73937749
  • Мария Цагиопулу
  • Библиотека Adobe PDF 21.1.174AppendPDF Pro 5.5 Ядро Linux 2. 6 64-разрядная версия 2 октября 2014 г. Библиотека 10.1.0 конечный поток эндообъект 2 0 объект > эндообъект 3 0 объект > эндообъект 4 0 объект > эндообъект 9 0 объект > эндообъект 10 0 объект > эндообъект 209 0 объект >]/P 47 0 R/Pg 13 0 R/S/Ссылка>> эндообъект 673 0 объект >]/P 197 0 R/Pg 26 0 R/S/Ссылка>> эндообъект 672 0 объект >]/P 195 0 R/Pg 26 0 R/S/Ссылка>> эндообъект 667 0 объект >]/P 151 0 R/Pg 23 0 R/S/Ссылка>> эндообъект 674 0 объект > эндообъект 675 0 объект > эндообъект 676 0 объект > эндообъект 677 0 объект > эндообъект 678 0 объект > эндообъект 679 0 объект > эндообъект 680 0 объект > эндообъект 681 0 объект > эндообъект 682 0 объект > эндообъект 683 0 объект > эндообъект 684 0 объект > эндообъект 685 0 объект > эндообъект 686 0 объект > эндообъект 687 0 объект > эндообъект 688 0 объект > эндообъект 689 0 объект > эндообъект 690 0 объект > эндообъект 691 0 объект > эндообъект 692 0 объект > эндообъект 693 0 объект > эндообъект 694 0 объект > эндообъект 695 0 объект > эндообъект 696 0 объект > эндообъект 697 0 объект > эндообъект 698 0 объект > эндообъект 699 0 объект > эндообъект 700 0 объект > эндообъект 701 0 объект > эндообъект 702 0 объект > эндообъект 703 0 объект > эндообъект 704 0 объект > эндообъект 705 0 объект > эндообъект 706 0 объект > эндообъект 707 0 объект > эндообъект 708 0 объект > эндообъект 709 0 объект > эндообъект 710 0 объект > эндообъект 711 0 объект > эндообъект 712 0 объект > эндообъект 713 0 объект > эндообъект 714 0 объект > эндообъект 715 0 объект > эндообъект 716 0 объект > эндообъект 717 0 объект > эндообъект 718 0 объект > эндообъект 719 0 объект > эндообъект 720 0 объект > эндообъект 721 0 объект > эндообъект 722 0 объект > эндообъект 723 0 объект > эндообъект 724 0 объект > эндообъект 725 0 объект > эндообъект 726 0 объект > эндообъект 727 0 объект > эндообъект 728 0 объект > эндообъект 729 0 объект > эндообъект 730 0 объект > эндообъект 731 0 объект > эндообъект 732 0 объект > эндообъект 733 0 объект > эндообъект 734 0 объект > эндообъект 735 0 объект > эндообъект 736 0 объект > эндообъект 737 0 объект > эндообъект 738 0 объект > эндообъект 739 0 объект > эндообъект 740 0 объект > эндообъект 741 0 объект > эндообъект 742 0 объект > эндообъект 743 0 объект > эндообъект 744 0 объект > эндообъект 745 0 объект > эндообъект 746 0 объект

    Последовательности, связанные с вирулентностью; результаты сравнительной геномики Streptococcus uberis различной вирулентности

    Abstract

    Исходная информация

    Streptococcus uberis, a Грамположительный каталазоотрицательный член семейства Streptococccaceae является важным экологическим патогеном, ответственным за значительную долю субклинических и клинические интрамаммарные инфекции крупного рогатого скота. В настоящее время описан геном только одного эталонного штамма (0140J). Здесь мы представляем сравнительный анализ последовательностей полных черновых геномов дополнительных двенадцати штаммов S. uberis .

    Результаты

    Общий и основной анализ генома показал, что основной геном, общий для всех штаммов, состоит из 1550 генов в 1509 ортологичных кластерах, дополненных 115-246 дополнительными генами, присутствующими в одном или нескольких штаммах S. uberis , но отсутствующими в эталоне. штамм 0140J.Большинство ранее предсказанных вирулентных генов присутствовали в основном геноме всех 13 штаммов, но между изолятами в CDS наблюдалось увеличение/утрата генов, связанное с сгруппированными короткими палиндромными повторами с регулярными интервалами (CRISPR), профагом и продукцией бактериоцина. Экспериментальные эксперименты с контрольным заражением подтвердили, что штамм EF20 не является вирулентным; способны инфицировать только транзиторным образом, который не приводит к клиническому маститу. Сравнение последовательности генома EF20 с валидированным вирулентным штаммом 0140J выявило гены, связанные с вирулентностью, однако они не имели четкой связи с клиническим/доклиническим статусом инфекции.

    Заключение

    Приобретение/утрата мобильных генетических элементов, таких как CRISPR и профаги, являются потенциальной движущей силой эволюционных изменений. Это первое «полногеномное» сравнение штаммов, выделенных в результате клинических и неклинических интрамаммарных инфекций, включая тип вирулентных и невирулентных штаммов, не выявило простых правил увеличения/утраты генов, которые легко объясняли бы или уверенно ассоциировались с различиями в вирулентности. . Это говорит о том, что более сложная динамика определяет инфекционный потенциал и клинический исход, а не просто содержание генов.

    Электронный дополнительный материал

    Электронная версия этой статьи (doi:10.1186/s12864-015-1512-6) содержит дополнительные материалы, доступные авторизованным пользователям.

    Ключевые слова: Мастит, Streptococcus uberis , Сравнительная геномика, vru , de novo сборка, CRISPRs

    Фон

    Реализация пяти пунктов Дезинфекция сосков, лечебно-профилактическое применение противомикробных препаратов и выбраковка персистентно инфицированных животных оказали значительное влияние на борьбу с интрамаммарными инфекциями, вызванными заразными возбудителями [1].Однако эти меры менее эффективны в борьбе с инфекциями, вызываемыми патогенами из окружающей среды, которые по-прежнему являются серьезным препятствием в борьбе с маститом. Streptococcus uberis, a Грамположительный каталазоотрицательный представитель семейства Streptococceae является важным экологическим патогеном, вызывающим мастит крупного рогатого скота, на долю которого приходится значительная часть субклинических и клинических интрамаммарных инфекций [2]. Мастит определяется как клинический, когда наблюдаются аномалии вымени или секреции, тогда как при субклиническом мастите вымя и молоко выглядят нормальными. Экономические последствия как субклинического, так и клинического мастита в молочной промышленности Великобритании превышают 200 миллионов фунтов стерлингов в год, а мировые экономические потери оцениваются в 35 миллиардов долларов США [3]. Таким образом, контроль над S. uberis с помощью стратегий, основанных на вакцинации, может значительно улучшить как экономику производства молока, так и благополучие животных [4]. Разработка вакцины против S. uberis сдерживалась отсутствием информации о взаимодействии возбудителя и хозяина [5].Примером этого недостатка знаний является нехватка информации о штаммах S. uberis на геномном уровне. В то время как более 900 штаммов S. uberis были типированы с использованием мультилокусного типирования последовательностей (MLST; http://pubmlst.org/suberis/), сообщалось только об одной последовательности генома из S. uberis, штамма . 0140J (номер доступа {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»AM946015″,»term_id»:»222113012″,»term_text»:»AM946015″}}AM946015), выбранный как типичный вирулентный британский штамм [6]. Геном 0140J (1 852 352 п.н.) является одним из самых маленьких секвенированных геномов Streptococcus, размер которого варьируется от 1,8 Мб до 2,3 Мб [6]. Это говорит о том, что в результате сокращения генома геном 0140J стал конденсированным, что, возможно, отражает ограниченный диапазон хозяев. Также возможно, что 1825 генов, кодирующих белки 0140J, содержат гены потенциальной вирулентности, отсутствующие у невирулентных штаммов, или что потеря дополнительных генов, присутствующих в других штаммах, может быть связана с вирулентностью 0140J.

    В качестве первоначальной попытки исправить недостаток геномной информации и определить степень вариации генома между S.uberis , геномы еще двенадцати штаммов были определены с использованием методов высокопроизводительного секвенирования. Штаммы, выбранные для секвенирования, являются репрезентативными для типизированных в настоящее время британских штаммов (рисунок ). Сравнение предсказанного содержания генов было выполнено для идентификации основного генома, общего для штаммов, и вариабельного дополнительного генома между штаммами. Хотя упрощенное представление о том, что наличие/отсутствие отдельных генов или кластеров генов можно использовать для прогнозирования вирулентности или клинического статуса, заманчиво, наш анализ показывает, что это не так.В дополнение к бактериальным факторам, такие сложности, как структура бактериальной популяции, генетика хозяина и иммунный статус хозяина, вероятно, играют роль в связи клинического статуса и бактериальной вирулентности.

    Мультилокусное типирование последовательностей (MLST) изолятов, использованных в исследовании. Распределение MLST 13 изолятов по сравнению с другими штаммами Великобритании, доступными в базе данных PubMLST. Профили MLST изолятов UK Streptococcus uberis были загружены из базы данных PubMLST (http://pubmlst.org/suberis/) и проанализированы с использованием опции goeBURST программы PHYLOViZ [20].

    Методы

    Выделение ДНК и секвенирование генома

    Бактерии из ряда клинических и субклинических изолятов (см. Дополнительный файл 1) инокулировали в бульон Тодда-Хьюитта и выращивали при 37°C в течение ночи с ДНК, экстрагированной из культур, как ранее описано [7].

    Сборка генома и аннотация

    Подготовка библиотеки и секвенирование каждого штамма проводились в DeepSeq, Медицинский центр Квинс, Ноттингем, Великобритания.1 мкг высокомолекулярной геномной ДНК S. uberis использовали для подготовки библиотек Illumina с использованием набора для подготовки образцов TrueSeq DNA LT (кат. № FC-121-2001), как описано в руководстве по подготовке образцов ДНК TrueSeq со следующими изменениями. . Фрагментацию ДНК проводили в коварисе S2 при следующих параметрах: Рабочий цикл — 10%, Интенсивность — 5, циклов на всплеск — 200, Время — 45 секунд, Режим — Развертка по частоте и температура — 6°С. Гель-метод был использован для выбора размера лигированной ДНК адаптера до 600–700 п.н. для создания библиотек с длиной вставки 500–600 п.н. для увеличенной длины считывания MiSeq.Секвенирование выполняли на платформе MiSeq с химией V2 (кат. номер, MS-102-2003) для создания парных концевых прочтений 2 × 250 п.н. Среднее количество прочтений на штамм составило 902 651. Чтения использовались для генерации сборок с помощью Velvet (версия 1.2.10) [8]. Максимум N50 использовался в качестве меры для определения оптимальной длины K-мера с использованием Velvetoptimiser (https://github.com/Victorian-Bioinformatics-Consortium/VelvetOptimiser), было выбрано минимальное покрытие 10x и использовалась опция –exp_cov ‘auto’ . CONTIGuator [9] был использован для сопоставления полученных контигов с эталонным геномом 0140J для сравнительного анализа геномных районов.

    Собранные контиги были аннотированы с помощью сервера Rapid Annotations using Subsystem Technology (RAST) [10]. Конвейер пангеномного анализа (PGAP версия 1.02) [11] был использован для идентификации ортологичных генов между двенадцатью секвенированными геномами и эталонным геномом 0140J с использованием метода семейства генов (GF) (50% охват и срезка значения e). -выкл 1e-10). Сходство выборок по наличию/отсутствию гена определяли с помощью иерархической кластеризации. Пакет pvclust (http://cran. r-project.org/web/packages/pvclust/) использовал меру корреляционного расстояния и метод средней агломерации.

    PILER-CR [12] и веб-сервер CRISPR [13-15] использовали для быстрой идентификации и классификации сгруппированных регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR). Инструмент поиска фагов (PHAST) [16] использовался для идентификации, аннотирования и графического отображения последовательностей профагов в проектах геномов. MUSCLE [17] использовался для множественного выравнивания. Веб-сервер snpTree [18] использовался для идентификации деревьев позиций SNP из конкатенированных 1377 основных генов 13 изолятов.PhyML [19] использовался для создания филогенетических деревьев с использованием модели GTR, оценивающей гамма-распределение и 4 категории скорости замещения. Было проведено 200 повторов начальной загрузки. Профили

    Multilocus Sequence Typing (MLST) изолятов UK Streptococcus uberis были загружены из базы данных PubMLST (http://pubmlst. org/suberis/) и проанализированы с использованием опции goeBURST PHYLOViZ [20]. Собранные контиги доступны в GenBank под инвентарными номерами, указанными в таблице .Аннотации RAST доступны в качестве дополнительного файла 2.

    Таблица 1

    Новый статистика сборки 12 Streptococcus uberis изоляты

    47 42 2 9999 99478

    636

    Изолировать Регистрационный номер GenBank Размер последовательности Количество контигов (>200 п.н.) Самый короткий размер пакета Размер самого длинного блока n50
    EF20 {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JANW00000000″,»term_id»:»810587226″,»term_text»:»JANW00000000″}} Janw0000000000000000000000174 1933244 18 369 369 1013731 1013547
    6736 {«Тип»: «Entrez-Nucleotide», «attb»: {«Текст»: «JATB00000000», «term_id» : «810606335», «term_text»: «JATB00000000»}} JATB00000000 28 392 424329 424329 386092
    6780 {«Тип»: «Entrez-Nugleotide», «: {» текст «:» jatd00000000 «,» term_id «:» 810601099 «,» term_text «:» JATD00000000 «}} jatd00000000 1960858 26 40920 404720 340682
    AB71 {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JATK00000000″,»term_id»:»810587215″,»term_text»:»JATK00000000″}}JATK00000000 1849250 12 449 792968 425420
    B190 {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«71term_0»:{«2term_0″:»JATE0000000» term_text «:» Jate00000000 «}} Jate00000000»}} Jate00000000 20 450 1043356 1043142
    962 b362 {«Тип»: «Entrez-Nucleotide», «Attrs»: {«текст» : «JATC00000000», «term_id»: «810606245», «term_text»: «jatc00000000»}} jatc00000000 1
    31 429 995597 995383
    C5072 {«Тип»: «Entrez-нуклеотид», «attrs»: {«текст»: «jati00000000», «term_id»: «810593222», «term_text»: «JATI00000000»}} jati00000000 12 19 431 1021112 1020928
    C5388 {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JATF00000000″,»term_id»:»810598486″,»term_text»:»JATF00000000 «}} Jatf00000000 7 13 409 4030174 1030559 1030365
    C6344 C6344 {» Тип «:» Entrez-Nucleotide «,» attrs «: {» Текст «:» Jata00000000 «, «term_id»: «810606613», «term_text»: «jata00000000»}} jata00000000 11 9 431 999672 999478 C8329 C8329 {«Тип»: «Entrez-Nucleotide» , «attrs»: {«текст»: «jatg00000000», «term_id»: «810593079», «term_text»: «jatg00000000»}} jatg0000000000009994 1923969 20 389 830811 455116
    C9359 {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JATJ00000000″,»term_id»:»810587135″,»term_text»:»JATJ00000000″}}JATJ00000000 1837704 04 11 450 1030658 1030464
    С6261 000 «,» term_id «:» 810593624 «,» term_text «:» Jath00000000 «}} jath00000000 26 429 613122 392636

    Для определения стабильности геномов Pan / Core , пангеном (общее количество генов, идентифицированных в группе образцов) и размер основного генома (гены, общие для группы образцов) определяли, когда от 2 до 13 геномов объединяли в случайном порядке. Для каждого размера комбинации (2…13 геномов) было проведено 1000 пермутаций.

    Заражение лактирующего молочного скота

    S. uberis 0140J или EF20

    Для подтверждения вирулентности двух штаммов S. uberis 5 молочных коров в возрасте от 24 до 30 месяцев были отобраны для экспериментального заражения в возрасте 4-8 недель. после отела с использованием хорошо зарекомендовавшей себя модели интрамаммарной инфекции. Критериями отбора были: отсутствие признаков мастита, отсутствие мастита в анамнезе во время текущей лактации и отсутствие бактерий в образцах молока, взятых за 24–48 ч до заражения, с соответствующим количеством соматических клеток (SCC) ниже 100 000 клеток/мл.Животных заражали в двух молочных четвертях после утреннего доения путем вливания 1 мл апирогенного физиологического раствора (Sigma), содержащего приблизительно 1 × 10 3  КОЕ S. uberis 0140J или EF20, приготовленного, как описано ранее [7].

    После контрольного заражения животных доили и осматривали дважды в день. Молоко и четверти вымени оценивали для определения тяжести заболевания с использованием заранее определенных критериев для клинических конечных точек (свернувшееся и обесцвеченное молоко и/или четверти вымени, набухшие или вызывающие дискомфорт при пальпации), как описано ранее [7].Молоко, собранное из зараженных четвертей при каждом доении (до 48 ч) после заражения, оценивали на количество бактерий и количество соматических клеток. Количество присутствующих жизнеспособных бактерий оценивали путем посева каждого образца молока на АВА, а количество соматических клеток, присутствующих в образцах молока, определяли с помощью портативного счетчика клеток ДеЛаваль в соответствии с инструкциями производителя.

    Результаты и обсуждение

    Общие характеристики геномов

    Streptococcus uberis

    Из 12 секвенированных штаммов семь были классифицированы как клинические и пять субклинических изолятов на основании состояния здоровья молочных коров во время сбора штаммов (Дополнительный файл 1) . Общая длина собранных контигов колеблется от 1 837 707 до 1 960 858 п.н. (таблица). Этот диапазон охватывает 1 852 352 п.н. эталонного штамма 0140J и находится в пределах 1,8–2,3 Мб, предсказанных Ward et al. [6]. Медианный размер геномов в каждой группе различается (клиническая медианная длина 1 887 233,5 п.н., субклиническая медианная длина 1 903 098,5 п.н.). Однако различия внутри обеих групп велики (клинический межквартильный диапазон: 74 423,5 п.н., субклинический: 55 387,5 п.н.), и в результате нет существенной разницы в общем размере генома (измеряемом по общему размеру собранных контигов) между двумя группами.Следовательно, это не подтверждает предположение о том, что клинические штаммы имеют геном уменьшенного размера, такой как 0140J. Это может отражать относительно расплывчатое определение клинических и субклинических штаммов. Чтобы исследовать взаимосвязь типа генома с фенотипом вирулентности, репрезентативный авирулентный штамм EF20 сравнивали в экспериментальной модели инфекции с клинически вирулентным штаммом 0140J. Все зараженные четверти заразились и выделили бактерии в обнаруживаемых количествах с первого доения (через 12 часов после заражения).Те, у кого был заражен штамм 0140J, выделяли бактерии при концентрации 10 4 КОЕ/мл молока через 12 часов после заражения, увеличиваясь до 10 6 -10 7 КОЕ/мл молока через 48 часов после заражения (рис. а). Напротив, те, кто подвергался заражению штаммом EF20, выделяли значительно меньше бактерий  ≤ 10 3 КОЕ/мл и обычно снижались примерно до 10 2 КОЕ/мл молока через 48 часов после заражения. Скорость клеточной инфильтрации молочной железы в ответ на инфекцию любым штаммом была одинаковой, однако величина инфильтрации была в 10 раз меньше после заражения штаммом EF20.Количество соматических клеток, обнаруженное после заражения штаммом 0140J, было сходным с тем, о котором сообщалось ранее для этого штамма [7, 21, 22] (рис. b). Уровни клеточной инфильтрации и бактериальной колонизации для каждой зараженной четверти показали значительную положительную корреляцию (R 2  = 0,404, P <0,001) в ходе эксперимента. Острые клинические признаки мастита (изменение состава молока, опухшая и воспаленная четверть вымени) возникали у всех животных, зараженных штаммом 0140J (рис. в).Напротив, у тех, кто заразился штаммом EF20, было мало изменений в составе молока и/или внешнем виде четвертей, если они вообще были обнаружены, что подтверждало и добавляло детали к предыдущим данным [23] относительно характера вирулентности этих двух штаммов и подтверждало их пригодность для прямое сравнение на геномном уровне для выяснения особенностей, связанных с вирулентностью.

    Выделение бактерий, подсчет соматических клеток и клинический ответ после заражения S. uberis 0140J и EF20 у молочного скота.Среднее геометрическое значение, полученное после заражения животных штаммом S. uberis 0140J (n = 10) или EF20 (n = 10). (a) Бактериальное выделение S. uberis при каждом доении после контрольного заражения, измеренное в КОЕ/мл молока (b) Приток клеток при каждом доении после контрольного заражения S. uberis , измеренное по количеству соматических клеток/ мл молока (c) Комбинированные клинические оценки клинических проявлений после заражения S. uberis .Данные представлены как среднее арифметическое клинических баллов, полученных для внешнего вида четверти и внешнего вида молока, как описано ранее [7].

    Проект генома EF20 состоит из немного большего генома по сравнению с 0140J. Собранный проект генома размером 1 933 244 п.н. имеет содержание G + C 36,5%, что сравнимо с содержанием G + C 36,6% в 0140J. В соответствии с его большим геномом, EF20 имеет увеличенное количество предсказанных кодирующих последовательностей 1957 по сравнению с 1825 последовательностями 0140J.На общем уровне сравнительный анализ EF20 и 0140J выявил синтению высокого уровня, нарушенную большим количеством событий увеличения/утраты генов и рекомбинации (рисунок ). Большее предсказанное количество генов в геноме EF20 — это не просто добавление в EF20 и/или потеря в 0140J. В то время как 1629 аннотированных генов являются общими для двух штаммов, штаммоспецифические гены присутствуют как в 0140J (145 генов присутствуют в 0140J, но не в EF20), так и в EF20 (222 гена присутствуют в EF20, а не в 0140J) (дополнительный файл 3: ортологическая кластеризация).Оперон метаболизма меди SUB1180-SUB1184 отсутствовал у EF20, однако сравнительные исследования роста при ограничительных уровнях меди, по-видимому, не по-разному влияют на скорость роста любого из штаммов (результаты не показаны). Это может быть связано с событием компенсаторной дупликации гена медного оперона, расположенного в области SUB 1462-SUB1464 . После секвенирования штамма 0140J был предложен список предполагаемых генов вирулентности для S. uberis [6]. Многие из них обнаружены в геноме EF20 и оказались интактными и, следовательно, предположительно функциональными, в том числе SUB1111 (фибронектин-связывающий белок), SUB1273 (гемолизин-подобный белок), SUB1154 (предшественник пептидазы C5a), SUB0881. (сортаза А), SUB0145 (белок, связывающий лактоферрин), SUB1095 (коллагеноподобный поверхностно-заякоренный белок), SUB1635 (белок SUAM), SUB1785 (предшественник стрептокиназы PauA), что свидетельствует о простом присутствии этих генов недостаточно для объяснения вирулентности S.уберис . Сравнение предполагаемых различий между метаболическими подсистемами выдвигает на первый план множественные различия (Дополнительный файл 4: Обогащение подсистемы). Тесты на ассоциацию ( х 2 с поправкой на множественную гипотезу Бенджамини-Хохберга p ≤ 0,05) идентифицируют десять подсистем, обогащенных либо 0140J, либо EF20. Кластер бактериальной контрольной точки, связанный с контролем, АТФ-синтаза типа F0F1, PTS, индуцируемые фруктозой и маннозой, система рестрикции-модификации, ассимиляция формальдегида: подсистемы пути рибулозомонофосфата и пути биосинтеза лизина DAP чрезмерно обогащены 0140J по сравнению с EF20.Принимая во внимание, что подсистемы использования D-тагатозы и галактита, репликации фага и устойчивости к кадмию обогащены EF20 по сравнению с 0140J.

    Сравнение сходства последовательностей 0140J и EF20. Самый внутренний темный кружок представляет эталонный геном 0140J (размер генома 1852 352 п.н.), а синий кружок, окружающий эталонный геном, представляет собой геном EF20. Изображение создано с помощью BRIG [40].

    Для дальнейшего выяснения сложности различий между штаммами S. uberis было проведено сравнение геномного содержания еще 12 секвенированных штаммов.Секвенирование нескольких штаммов данной бактерии позволяет определить основной геном, общее количество генов, общих для всех секвенированных штаммов, было обнаружено, что 1550 генов между 12 собранными штаммами и идентифицированным 0140J (дополнительный файл 3: core_genome) в 1509 ортологичных кластерах (дополнительный файл 3: RAST_orthologous_clusters). Путем многократного сравнения кластеров общего ядра генома, полученных из 1000 случайных комбинаций штаммов, мы можем увидеть, что для двух геномов средний размер общего ядра генома составляет 1635 генов с дисперсией (межквартильный диапазон) 44 генов. При сравнении 5 собранных геномов медиана составляет 1560 с межквартильным диапазоном 29 генов. Если сравнить 10 геномов, размер основного генома стабилизируется на уровне 1521 гена, а межквартильный диапазон составляет 16 генов (рис. а). Идентифицированный основной геном S. uberis содержал кластеры генов или опероны генов, необходимых для клеточного роста и репликации, включая те, которые участвуют в синтезе клеточной стенки и капсулы, клеточном делении, регуляции клеточного цикла и передаче клеточных сигналов, мембранном транспорте (системы секреции белка), Метаболизм РНК/ДНК, метаболизм кофакторов, ароматических соединений, аминокислот и их производных (метаболизм аргинина, лизина, треонина), усвоение и использование фосфора, жирных кислот и липидов, а также углеводов.

    Связь между количеством генов и размером генома. Чтобы определить стабильность пан/ядерных геномов, (a) размер основного генома (количество общих генов в образцах) и (b) размер пангенома (общее количество различных генов, идентифицированных в образцах) определяли, когда между 2 и 13 геномов были объединены в случайном порядке. Для каждого размера комбинации (2…13 геномов) было проведено 1000 пермутаций. Коробчатые диаграммы представляют медианный и межквартильный диапазоны 1000 перестановок, усы простираются до крайних значений.

    Анализ пангенома

    Размер пангенома (общее количество генов в группе геномов) был определен для измерения относительной сложности геномов S. uberis . С 10-12  геномов S. uberis количество новых генов, идентифицированных с добавлением дополнительного генома, замедляется, но не выходит на плато (рис. b), что предполагает открытый пангеном [24]. Вместе эти сравнения основного и пангеномов позволяют предположить, что секвенирование относительно небольшого числа штаммов охватило большинство, но не все варианты S.uberis геномов.

    Прямое сравнение всех вновь секвенированных геномов с имеющимся штаммом 0140J позволяет выявить от 115 до 246 дополнительных генов, присутствующих в одном или нескольких штаммах S. uberis , но отсутствующих в штамме 0140J. Исходя из предположения, что геномы клинических штаммов меньше, было обнаружено, что клинические изоляты имеют немного меньше дополнительных генов (медиана 180,5), чем субклинические изоляты (медиана 193,5), однако опять же эти различия не были статистически значимыми.Кроме того, иерархическая группировка штаммов, основанная на их общем содержимом дополнительного генома, не группирует штаммы по клиническому статусу (рисунок ). Выравнивание 1377 соединенных основных генов, содержащих 1 294 803 нуклеотида, выявило 12 982 вариабельных сайта (SNP). Для учета возможной рекомбинации, влияющей на филогению, был проведен Phi-тест [25] на 500 базовых окнах основного генома. После поправки Бонферрони окна со значительным свидетельством ( p  < 0.05) рекомбинации были замаскированы из выравнивания (1386 окон всего замаскировано 6 930 000 оснований) и филогения определена с использованием PhyML, как описано в методах. В то время как поддержка начальной загрузки была затронута, топология дерева не пострадала от маскировки возможных областей рекомбинации. В соответствии с общим содержимым генов кластеризация на основе наличия или отсутствия общих SNP различает геномы на основе клонального комплекса ST, а не по клиническому статусу (рисунок ).

    Пангеномная кластеризация изолятов S uberis .Сходство выборок по наличию/отсутствию гена определяли с помощью иерархической кластеризации (pvclust) (http://cran.r-project.org/web/packages/pvclust/). Красная звездочка обозначает вирулентный штамм 0140J, синяя звездочка — невирулентный штамм EF20. Штаммы, изначально зарегистрированные как клинические изоляты, обведены красным.

    Полногеномная филогения изолятов Streptococcus uberis . Объединенное выравнивание 1377 ядерных генов 13 изолятов было сгенерировано с помощью snpTree [18]. Фи-тест [25] был проведен на 500 неперекрывающихся базовых окнах этого выравнивания.После поправки Бонферрони эти окна со значительным свидетельством ( p  < 0,05) рекомбинации были замаскированы из выравнивания и филогении, определенных с помощью PhyML [19] с использованием модели GTR, рассчитанной гамма-распределением и 4 категориями скорости замещения. Было проведено 200 повторов начальной загрузки. Штаммы, изначально зарегистрированные как клинические изоляты, обведены красным.

    Сравнение факторов вирулентности

    Как с предыдущим сравнением EF20 и 0140J Зарегистрированные гены вирулентности SUB1111 , SUB1273 , SUB1154 , SUB0881 , SUB0145 , SUB1095 , SUB1635 и SUB1785 были обнаружены в основном геноме всех других секвенированных штаммов.Хотя присутствие этих генов сохраняется в клинических и неклинических штаммах, они действительно демонстрируют ряд консервативных последовательностей между штаммами. PauA ( SUB1785 ) и гемолизиноподобный белок ( SUB1273 ) очень хорошо консервативны между 12 штаммами только с 3 и 5 вариабельными сайтами соответственно в генах размером более 800 п.н. (таблица а). Напротив, коллагеноподобный поверхностно-заякоренный белок ( SUB1095 ) и лактоферрин-связывающий белок ( SUB0145 ) сильно варьируют от 0. 4 SNP/пн. Эталонный штамм 0140J содержит единственную копию гена ( SUB 0881), гомологичного сортазе А (srtA). Было показано, что мутация трансамидазы srtA a, которая ковалентно связывает подгруппу белков с пептидогликаном на поверхности S. uberis, снижает инфекционный потенциал S. uberis [7]. Это говорит о том, что заякоренные сортаза белки содержат один или несколько факторов вирулентности, важных для установления инфекции. Известно, что заякоренные сортазой белки S. uberis содержат консервативный аминокислотный мотив LPxxG или LPxxxD [7].Используя присутствие любого из этих мотивов вместе с предсказанным секреторным лидерным мотивом, 10 генов ( SUB0135, SUB0145, SUB0207, SUB0241, SUB0826, SUB0888, SUB1095, SUB1154, SUB1370 и SUB1730 ) были идентифицированы как предсказанные потенциальные белки, заякоренные сортазой. Девять из них были подтверждены сравнительным протеомным анализом [7], а SUB 0241 — нет. Было показано, что заякоренные гены сортазы SUB0145 , SUB1095 и SUB1154 важны при инфекции и были предложены в качестве кандидатов на вирулентность [7]. У мутантов S. uberis , у которых эти гены были инактивированы, способность заражать крупный рогатый скот была ослаблена [7]. Из них SUB0145 и SUB1095 сильно различаются между штаммами (таблица b), что позволяет предположить, что различия между ними поддерживаются естественным отбором, что, в свою очередь, предполагает, что это может быть обусловлено взаимодействием с иммунной системой хозяина. Наоборот, SUB1154 более консервативен между штаммами (0,021 SNPs/bp выровнены). Использование RAST для передачи аннотации из ссылки 0140J показало, что SUB 1095 был уникальным для 0140J.Поскольку это важный фактор вирулентности, мы вручную проверили, действительно ли этот ген отсутствует у всех других штаммов. Однако с помощью средства быстрого переноса аннотаций (RATT) ортолог SUB 1095 можно было обнаружить во всех секвенированных геномах, что позволяет предположить, что RAST не смог аннотировать этот ген из-за высокой изменчивости SUB 1095.

    Таблица 2

    Распределение SNP (a) известных генов вирулентности (b) белков, закрепленных сортазой

    0241 0 SUB 1154 1730
    Джин Функция гена Количество SNP Размер гена (п.н.) Размер выравнивания (bp) СНП/бп
    (а)
    SUB 1785 PauA (предшественник стрептокиназы) 3 861 861 0. 003
    SUB 1273 Гемолизинподобный белок 5 828 828 0,006
    SUB 0881 Сортаза А (srtA) 8 759 759 0,011
    3 SUB 1154 Предшественник пептидазы C5a 73 3480 3362 0,022
    0 SUB 1635 белок SUAM 52 2637 2637 0.020
    SUB 1111 Белок, связывающий фибронектин 42 1653 1653 0,025
    0 0 (б)
    SUB 0135 предполагаемый предшественник фруктан-бета-фруктозидазы 36 3810 3810 0,009 SUB 0145* белок, связывающий лактоферрин 552 1819 1352 0.408
    SUB 0207 предполагаемый поверхностно-заякоренный белок sub 0241 Поставительная на якорь 2 ‘, 3′-циклический нуклеотид 2’-фосфодиейэстераза 48 2478 2457 0.020
    0047
    SUB 0888 предполагаемый поверхностно-заякоренный белок SUB 1095* коллагеноподобный поверхностно-заякоренный белок 375 1452 935 0,260
    Предшественник пептидазы C5A 73 3480 3435 0,021
    0 SUB 1370 предполагаемая карбоксипептидаза цинка 58 3225 3213 0.018
    Sub 1730 Поставительный на якорь белка 128 1191 1191 1020 0.125 0.125

    Анализ имеет оперин

    Капсула гиалуроновой кислоты S. Pyogenes значительную роль в патогенезе инвазивных бактерий Streptococcus группы A (GAS) [26], [27]. Штаммы S. uberis , выделенные из случаев мастита крупного рогатого скота, обнаруживают переменное количество капсулы гиалуроновой кислоты [6], что позволяет предположить, что капсула может быть связана с инфекцией.Тем не менее, Field et al., 2003, показали, что капсулоотрицательные мутанты по-прежнему могут вызывать мастит [21], а наличие большего количества капсул у клинических изолятов, чем у изолятов из окружающей среды [28], может быть связано с тем, что капсула предотвращает высыхание в окружающей среде и позволяет ему сохраняться дольше, увеличивая шансы на последующую инфекцию или даже кишечную колонизацию. У S. uberis 0140J расположение генов биосинтеза гиалуроновой кислоты, входящих в состав has оперона, отличается от типичного для GAS расположения hasABC [28].H asA ( SUB1697 ), кодирующий гиалуронансинтазу, и hasB ( SUB1696 ), кодирующий UDP-глюкозодегидрогеназу, расположены так же, как и в других GAS. Однако гомолог hasC ( SUB1691 ), кодирующий UDP-глюкозопирофосфорилазу, кодируется в обратной ориентации и отделен от hasAB примерно 3 т.п.н. генома, кодирующего CDS, которые, как считается, не связаны с биосинтезом капсулы [6]. Маловероятно, что такое расположение влияет на производство капсул, так как в GAS капсула зависит только от функционального hasA и hasB , но не hasC [29].Все изоляты, секвенированные здесь, за исключением штамма B362, имеют ABC в расположении, аналогичном найденному в 0140J. В девяти штаммах S. uberis был идентифицирован паралог hasB ( SUB1027 ). В некапсульном, невирулентном изоляте EF20 отсутствует SUB1027 , и этот ген также отсутствует в изолятах B362, 6780 и B190.

    S. uberis SUB0144 является гомологом регуляторного гена вирулентности S. pyogenes mga. SUB0144 ( вру ) из С.Было обнаружено, что Uberis регулирует ряд вирулентных генов, в том числе HASA и ASB1 и ( SUB1696 и SUB1697 ), LBP ( SUB0145 ), SCLB ( SUB1095 ) и PAUA ( SUB1785 ) а инактивация vru приводила к снижению способности колонизировать молочную железу, а также уменьшению клинических признаков мастита по сравнению со штаммом дикого типа [30]. Более того, Flores et al. показали, что делеция 12 п.н. в области VNTR промотора mga в положениях от -63 до -75 изменяет вирулентность GAS, приводя к бессимптомному фенотипу носительства [31].У S. uberis мы наблюдаем делецию пяти п.н. в аналогичной области vru (положения от -75 до -79). Эта делеция была обнаружена в нескольких изолятах, включая невирулентные штаммы EF20 и 6736. Делеция в четыре п.н. была обнаружена в положениях от -76 до -79 в пяти изолятах Ab71, C9359, B362, C5388 и C8329 (рис. ). Несмотря на то, что эта делеция не является идеальной, она была обнаружена в большинстве субклинических изолятов и только в трех клинических изолятах. Следовательно, вариации в этой области могут играть важную роль в регуляции этого регуляторного гена и, в свою очередь, влиять на взаимодействие хозяин-патоген.

    Разновидность вру вышестоящих регионов. Выравнивание восходящего участка гена vru по 13 штаммам было произведено с помощью Muscle [17]. Сервер Boxshade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html) использовался, чтобы подчеркнуть высокую степень сохранности в выровненной области. Положение инициирующего кодона метионина (ATG) показано стрелкой. Делеция TATAA обнаружена у изолятов EF20, 6736 и 6780 в положениях от -75 до -79 гена vru .Полиморфизм от А до Т обнаружен в области -79 вместе с делецией четырех оснований ТАТА в областях от -75 до -78 изолятов B362 и C8329. Делеция четырех оснований ATAA (от -76 до -79) была обнаружена в 3 изолятах Ab71, C5388 и C9359.

    Анализ белков CRISPR-Cas

    CRISPR-Cas (кластеризованные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы – CRISPR-ассоциированные белки), идентифицированные примерно у 40% бактерий и большинства архей, представляют собой геномные области, участвующие в адаптивном иммунитете против вторгающихся генетических элементов например вирусы [32-37].Гены CRISPER-Cas были обнаружены во всех штаммах, кроме EF20 и 0140J. В штаммах, отличных от EF20 и 0140J, система типа II [38], которая включает тип «HNH» ( Streptococcus -подобный), содержащий Cas9/Csn1 (один большой белок), располагалась в консервативной области между генами . SUB1084-SUB1085 (рисунок ). Дополнительный набор генов cas1-cas6 типа III [38] был обнаружен в изоляте B362, вставленном между генами SUB 0330- SUB 0333. В изолятах EF20, Ab71 и C5072 произошла вставка двух генов, гомологичных Streptococcus pneumoniae интегративных и конъюгативных элементов (ICE) присутствуют в гомологичной области между SUB1084-SUB1085 (рис. ).

    Сравнительный анализ областей CRISPR типа II в различных изолятах. Относительное положение генов CRISPR-Cas в 13 изолятах. Невирулентный штамм EF20 вместе с изолятами Ab71 и C5072 содержит белки семейства хеликаз вместо областей CRISPRs между генами SUB1084 и SUB1085 .

    Анализ профаговых областей

    Растущие данные свидетельствуют о значительной роли профаговых областей в вирулентности и эволюции многих бактерий.Например, было обнаружено, что лизогения способствуют вирулентности ряда организмов, включающих Vibrio Cholerae , Salmonella Enterica , Escherchia Coli , Coldtridium Botulinum , Corynebacterium Diphtheriae , Staphylococcus Aureus и Streptococcus pyogenes [39]. Анализ профаговых областей показывает, что среди тринадцати изолятов семь имели интактные профаговые области (таблица). Невирулентный изолят EF20 и субклинический изолят B362 не имели идентифицированных областей профага.Неполная область профага очевидна в области SUB1818-SUB1840 изолята 0140J, и эта область изменчива в большинстве изолятов. Разнообразие этих областей профагов может способствовать адаптации лизогенов к новым хозяевам.

    Таблица 3

    Распределение профаговых областей среди 13 изолятов

    971 0065 1452 174 _nc_009018 1452
    Штамм Регион Длина Статус # КДС Предполагаемый фаг ГК % Расположение по сравнению с 0140J
    0140J 1 неполный 28 Lactococcus_phage_3bIL343 3 3 3 36 SUB SUB 1818- 1840
    EF20 Отсутствует
    6736 1 33.5Kb неповрежденными 51 PHAGE_Strept_5093_NC_012753 35,1 Sub 1470- Sub 1471
    6780 1 35.3kb Assessable 23 Phage_Strept_ph20_nc_012756 40.6 sub 1176- sub 1187
    ab71 1 12.9KB Неполное 15 Phage_lactoc_bil311_nc_002670 33.1 Sub 1818- Sub 1840 1840
    B190 1 394KB INTACT 56 56 Phage_004584 34.9 Sub 0062- Sub 0065
    C5072 1 47.7Kb под вопросом 58 PHAGE_Strept_pyogenes_315_2_NC_004585 39,7 Sub 1531- Sub 1532
    2 15.8kb Неполные 25 Phage_Lactoc_bil311_nc_002670 32.8 Sub 1818- Sub 1840174
    C5388 1 40,8KB INTATT 57 PHAGE_STREPT_P9_NC_009819 37.4 Sub 1748- Sub 1452
    C6344 1 46.6kb Assessable 58 Phage_Sstrept_Pyogenes_315_2_nc_004585 38.5 38.5 Sub 1531- Sub 1532
    2 39.6kb INTACT 54 Phage_STREPT_SMP_NC_008721 36.8 SUB 1748- SUB 1452
    C8329 1 11.5Kb неполный 15 PHAGE_Staphy_phi2958PVL_NC_011344 40,2 Sub 1183- Sub 1190
    2 4 45.7kb INTATT 56 Phage_009018 36.5 sub 1531- sub 1532
    3 3 37.6kb questable 38 Phage_lactoc_bil311_nc_002670 35.3 sub 1818- sub 1840 199
    C9359 1 40,8KB INTATT 57 Phage_Strept_P9_NC_009819 37.4 sub 1748- sub 1452
    S6261 1 51.8kb INTATT 68 Phage_Strept_tp_j34_nc_020197 36.4 SUB 1263- SUB 1270

    Анализ продукции бактериоцинов

    Бактериоцины представляют собой белковые антибиотики, вырабатываемые бактериями, которые убивают или ингибируют рост других бактерий, часто обеспечивая преимущество в условиях конкурентной колонизации.Уберолизин представляет собой новый циклический бактериоцин, продуцируемый S. uberis , кодируемый опероном, охватывающим SUB 0032- SUB 0036. Этот оперон отсутствует в EF20 и изоляте C9359, но присутствует во всех других секвенированных штаммах. Анализ генома 0140J выявил пять генов, кодирующих предполагаемые белки бактериоцина ( SUB0502, SUB0505, SUB0506, SUB0509 и SUB0512 ) [6], из которых SUB502-SUB505 снова отсутствуют в EF20, а также в изолятах B362 и 6780, оба из которых относятся к комплексу СТ-86.Хотя продукция бактериоцинов не определяет клинические и субклинические штаммы, отсутствие почти всех бактериоцинов в геноме EF20 может поставить его в невыгодное положение по сравнению с другими штаммами из окружающей среды в среде дойных коров и может отражать (но не объяснять) его не- вирулентный статус.

    Выводы

    Сравнение нескольких штаммов близкородственных бактерий дает ценный ресурс для понимания биологических систем. Сравнение 12 вновь секвенированных штаммов вместе со штаммом типа 0140J штамма Streptococcus uberis позволяет провести первое сравнение бактерий, выделенных при клинических и неклинических инфекциях, и создать проект генома штамма EF20 вместе с существующим геномом 0140J. впервые сравнение двух встречающихся в природе штаммов S.uberis с определенной вирулентностью. Сравнение штаммов не выявило явного «дымящегося гена», присутствующего или отсутствующего между вирулентными или авирулентными штаммами, чтобы предположить ранее неизвестный фактор вирулентности. Кроме того, содержание генома не отличалось между клиническими и неклиническими штаммами. Однако стоит учитывать, что статус как клинический, так и неклинический относится к состоянию животного-хозяина, от которого был получен изолят, а не к возбудителю.Например, подтвержденный невирулентный штамм EF20 был выделен из клинического случая и, следовательно, назван клиническим штаммом, но это могло быть связано с другими факторами, такими как коинфекция другим видом/штаммом бактерий и, что важно, генетикой гостья. Таким образом, хотя представленные здесь данные представляют собой подробное сравнение бактериальных штаммов S. uberis , для полного понимания вирулентности и причин заболевания мы должны применять целостный подход, охватывающий бактерии, хозяина и окружающую среду.

    Представление базы данных

    Прочитанные последовательности и собранные контиги доступны в GenBank под номером {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»JANW00000000″,»term_id»:»810587226″,» term_text»:»JANW00000000″}}JANW00000000, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JATB00000000″,»term_id»:»810606335″,»term_text»:»JATB00000000″} }JATB00000000, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»JATD00000000″,»term_id»:»810601099″,»term_text»:»JATD00000000″}}JATD00000000, {«type» :»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JATK00000000″,»term_id»:»810587215″,»term_text»:»JATK00000000″}}JATK00000000, {«type»:»entrez-нуклеотид», «attrs»:{«text»:»JATE00000000″,»term_id»:»810598972″,»term_text»:»JATE00000000″}}JATE00000000, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст «:»JATC00000000″,»term_id»:»810606245″,»term_text»:»JATC00000000″}}JATC00000000, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»JATI00000000″,» term_id»:»810593222″,»term_text»:»JATI00000000″}}JATI00000000, {«type»:»entrez -нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JATF00000000″,»term_id»:»810598486″,»term_text»:»JATF00000000″}}JATF00000000, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs» :{«текст»:»JATA00000000″,»term_id»:»810606613″,»term_text»:»JATA00000000″}}JATA00000000, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:» JATG00000000″,»term_id»:»810593079″,»term_text»:»JATG00000000″}}JATG00000000, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»JATJ00000000″,»term_id»: «810587135», «term_text»: «JATJ00000000»}} JATJ00000000, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»JATH00000000″,»term_id»:»810593624″,»term_text» :»JATH00000000″}}JATH00000000.

    Выявление линий SARS-CoV-2 и мутационной нагрузки в муниципальных сточных водах и вариант использования в столичном районе Салоники, Греция

    Отбор проб и изоляция город, который вмещает канализацию около 750 000 жителей. Сточные воды, поступающие на этот завод, относятся исключительно к жителям городских округов города. Типичные значения некоторых физико-химических свойств образцов сточных вод, протестированных в данном исследовании, приведены в таблице 6.Эти свойства демонстрируют, среди прочего, наличие взвешенных твердых частиц, растворенных органических веществ, растворенного кислорода и солености, которые могут оказывать сильное влияние на адсорбцию и разложение вирусов из-за окисления и повышенной метаболической активности микроорганизмов в сточных водах. Время пребывания сточных вод до входа на завод составляет от 2 до 7 часов (в зависимости от площади), что более чем достаточно для адсорбции и разложения вирусов. Идентификация мутаций может быть затруднена адсорбцией и распадом вируса, и по этой причине настоящие усилия особенно важны.

    Таблица 6 Основные качественные характеристики проб сточных вод.

    Отбор и обработка проб сточных вод выполнялись в соответствии с Petala et al. 3 . Вкратце, образцы были получены с использованием автодозатора с охлаждением (6712 Teledyne ISCO), запрограммированного на подачу 24-часового составного образца путем смешивания последовательных получасовых образцов. Образцы были доставлены в лабораторию на льду и немедленно обработаны. Три аликвоты по 50 мл каждого образца неочищенных сточных вод подвергали центрифугированию при 4000× g в течение 30 мин.После этого из супернатантов был получен составной образец, и рН был доведен до 4 с использованием 2 М раствора HCl. Затем три аликвоты по 40 мл каждая фильтровали через соответствующие электроотрицательные мембраны с размером пор 0,45 мкм и диаметром 47 мм (HAWP04700; Merck Millipore, Ирландия) для связывания нуклеокапсида Sars-CoV-2. Каждый мембранный фильтр был закатан в 15-мл коническую центрифужную пробирку Falcon верхней стороной внутрь, и был подвергнут РНК-экстракции ОТ-ПЦР в реальном времени и тестированию на количественное определение SARS-CoV-2 в отдельном помещении, где не было клинических образцов. обрабатываются, чтобы исключить возможность загрязнения.Для каждого цикла отбора проб сточных вод холостой отрицательный контроль воды обрабатывался и обрабатывался теми же этапами на протяжении всей процедуры.

    Экстракция РНК и количественное определение SARS-CoV-2

    Каждая электроотрицательная мембрана была подвергнута процессу экстракции РНК на основе фенол-хлороформного метода 17 в сочетании со связыванием магнитных шариков. Последовательно добавляли следующие реагенты: (а) 900 мкл «Лизисного буфера I» на основе изотиоцианата гуанидиния [5 М изотиоцианата гуанидиния, 25 мМ ЭДТА, 25 мМ цитрата натрия (pH 6.2), 25 мМ фосфатный буфер (pH 6,4)], содержащий 1 % N-лауроилсаркозина, 2 % Triton X-100, 2 % CTAB и 2 % PVP, (b) 18 мкл β-меркаптоэтанола, (c) 300 мкл H 2 О. Пробирки тщательно перемешивали переворачиванием и инкубировали при 4°С на горизонтальном ротаторе (50 об/мин) в течение 10–30 мин. Затем 1,2 мл «Лизисного буфера II» [полученного путем смешивания 152,5 г гидрохлорида гуанидиния, 31,25 мл 2 М ацетатного буфера (pH 3,8), 12 мл уксусной кислоты и насыщенного водой фенола, стабилизированного (pH 4), до конечного объема. 500 мл] с последующей инкубацией на горизонтальном ротаторе (150 об/мин, 10 мин, КТ).Жидкую фазу переносили в микроцентрифужную пробирку на 2 мл, осветляли центрифугированием (21000× g , 5 мин, 4°С) и 1,6 мл супернатанта переносили в новую пробирку на 2 мл, в которой 200 мкл добавляли хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) с последующим энергичным встряхиванием в течение 30 с, инкубацией (- 20 °C, 30 мин) и центрифугированием (21 000 × г , 10 мин, 4 °C). Верхнюю водную фазу (800 мкл) переносили и смешивали с 667 мкл изопропанола и 20 мкл магнитных шариков (набор IDEXX Water DNA/RNA Magnetic Bead Kit; IDEXX Laboratories Inc., Уэстбрук, Мэн, США) с последующей инкубацией на горизонтальном ротаторе (150 об/мин, 15 мин, КТ). Шарики промывали в соответствии с протоколом производителя. РНК элюировали в 100 мкл буфера, а элюаты подвергали фильтрации с использованием набора для удаления ингибиторов ПЦР OneStep (Zymo Research Corporation, Ирвин, Калифорния, США) и хранили при температуре — 80 °C. Экстрагированные РНК, происходящие из 12 обработанных электроотрицательных мембран и охватывающие 6 разных дней отбора проб, объединяли (1,1 мл общего экстракта РНК) и смешивали с 2.2 мл буфера для связывания, содержащего изопропанол (набор IDEXX Water DNA/RNA Magnetic Bead Kit). Половину смеси (1,65 мл) инкубировали с 20 мкл магнитных шариков на горизонтальном ротаторе (150 об/мин, 15 мин, КТ). После магнитного разделения шариков супернатант удаляли и повторяли процедуру, добавляя оставшиеся 1,65 мл смеси. Гранулы промывали в соответствии с протоколом производителя и элюировали РНК в 60 мкл буфера.

    Концентрированные РНК были подвергнуты ОТ-ПЦР в режиме реального времени для количественного определения SARS-CoV-2 с использованием протокола N2, предложенного Центрами по контролю и профилактике заболеваний (CDC) для диагностики COVID-19 у людей (CDC, 2020).Анализ проводили на системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США). Калибровочные кривые были построены с использованием стандарта синтетической одноцепочечной РНК «EURM-019» (Объединенный исследовательский центр, Европейская комиссия), а вирусная нагрузка SARS-CoV-2 была выражена в виде копий генома на мкл экстракта РНК.

    Подготовка библиотеки и секвенирование

    Метод направленного секвенирования был применен путем подготовки ампликонов из 400 нуклеотидов с использованием протокола ARTIC v3, разработанного Wellcome Sanger Institute 18 , с некоторыми модификациями.Сначала синтез кДНК готовили из 10 мкл РНК с использованием обратной транскриптазы Super Script II (Invitrogen—Thermo Fisher Scientific, США) и 50 нг/мкл случайных праймеров в соответствии с рекомендациями протокола. Для последующей амплификации кДНК использовали 2,5 мкл сгенерированной кДНК вместо 6 мкл с использованием пулов праймеров ARTIC PCR (v3). В зависимости от платформы для секвенирования библиотеки были отправлены или нет в рабочий процесс FS DNA для Illumina посредством стадии фрагментации в течение 30 минут при 37 °C с использованием реагентов NEBNext Ultra II FS (NEB#7658).Наконец, в реакции лигирования использовали адаптер NEBNext (New England Biolabs, США, № 7335), разбавленный буфером для разбавления адаптера в конечной концентрации 10 мкМ. Все этапы очистки проводили в соответствии с протоколом ARTIC. Образцы были парными концами, секвенированы либо на платформе MiSeq, либо на платформе NextSeq500 (Illumina, США) с длиной считывания 2 × 300 и 2 × 150 п.н. соответственно.

    Создание библиотеки и секвенирование выполнялись в помещении CERTH INAB. Диагностический центр CERTH сертифицирован по стандарту ISO 15189.Все этапы выполняются в специально отведенных физически разделенных зонах с соблюдением соответствующих мер. В течение всего процесса использовались все необходимые средства контроля, как негативные, так и позитивные, в соответствии с Надлежащей лабораторной практикой и принятыми СОП.

    Анализ необработанных данных

    Начальная фаза биоинформатического анализа заключается в выравнивании показаний секвенирования при соблюдении чрезвычайно строгих критериев для удаления любых потенциальных загрязнений и/или ошибок секвенирования.Первым шагом является процесс удаления адаптера, при котором все адаптеры удаляются из необработанных последовательностей fastq , а очищенные считывания сопоставляются с эталонным геномом SARS-CoV-2 (вариант Ухань, NC_045512) с использованием инструмента Minimap2 19 с минимальная оценка цепочки (совпадающие основания минус штраф за логарифмический разрыв), равная 40. В этом процессе были сохранены только последовательности с парными концами, в то время как любые другие (несопоставленные, множественные сопоставления и т. д.) были удалены. На следующем этапе были использованы два разных вычислительных рабочих процесса, соответствующих двум разным длинам последовательностей: 150 или 300 оснований парных концов, используемых в зависимости от платформы NGS.Для первых семи образцов и последних трех образцов (2 декабря 2020 г. – 18 марта 2021 г. и 16 апреля 2021 г. – 06 мая 2021 г.) последовательности праймеров исключаются с помощью инструмента iVar 20 , при этом минимальная длина составляет 200 нуклеотидов. для сохранения чтения после обрезки и минимального порога для прохождения скользящего окна качества 15 (ширина скользящего окна равна 4). Окончательные последовательности затем повторно сопоставляются с тем же эталонным геномом (минимальная оценка цепочки равна 40). Для четырех образцов в период с 19 марта 2021 г. по 15 апреля 2021 г. обрезка праймеров и повторное сопоставление с эталонным геномом не применялись, поскольку используемый обновленный протокол не требовал этого шага.Наконец, чтобы иметь возможность обнаруживать низкочастотные мутации, использовали вызывающий вариант freebayes с параметром низкой частоты мутаций, равным 0,01. В конечном итоге все выявленные мутации были аннотированы с использованием инструмента SnpEff 21 и базы данных NC_045512.2 (версия 5.0). Предлагаемый вариант вызова пайплайна (со всеми заданными параметрами) представлен в репозитории GitHub.

    Последующий анализ обнаружения линий

    Чтобы идентифицировать и определить различные линии SARS-CoV-2 на основе мутаций, обнаруженных в одном образце сточных вод, мы внедрили предложенную методологию в инструмент под названием lineagespot .

    Инструмент принимает в качестве входных данных файл VCF, который содержит все нуклеотидные (и соответствующие аминокислотные) мутации, идентифицированные в образце, а также файл, содержащий все мутации, относящиеся к происхождению. После анализа всех входных данных создается файл с разделителями табуляции (файл TSV), содержащий выявленные мутации, связанные с линиями SARS-CoV-2. Кроме того, мы вычисляем средние частоты аллелей для количественной оценки показателей численности линии. На рис. 5 представлен обзор функций инструмента.

    Рисунок 5

    Снимки промежуточных шагов. ( A ) Сводный график, показывающий общий процесс от выборки до точки родословной. ( B ) Файл VCF, созданный выбранной вызывающей стороной ( C ). Замены характеристик SARS-CoV-2 получены либо из общедоступного источника (например, Pangolin или outbreak.info), либо предоставлены пользователем. ( Д ). Файл с разделителями табуляции, созданный lineagespot .

    lineagespot зависит от источника, используемого для получения определений родословных. В нашем случае двумя потенциальными источниками являются (1) профили мутаций, характерных для линии, предварительно рассчитанные с помощью outbreak.info, и (2) профили мутаций, характерные для линии, полученные из обученных моделей панголинов. И outbreak.info, и Pangolin являются доступными ресурсами (https://cov-lineages.org/resources.html) для мониторинга вспышки SARS-CoV-2, и их данные предоставлены GISAID. В этом разделе мы опишем процесс для обоих случаев; однако, учитывая тот факт, что определения Pangolin основаны на обученной модели машинного обучения, которая не обязательно поддается интерпретации, lineagespot по умолчанию использует первый вариант (т.е. outbreak.info как источник определений):

    1. я.

      Outbreak.info как источник определений происхождения

      По умолчанию lineagespot использует outbreak.info для получения информации о назначении родословной. Для этого используется либо API, из которого извлекается информация о рассматриваемых вариантах или указанных пользователем вариантах и ​​соответствующих аминокислотных заменах, либо предоставленные пользователем файлы с разделителями табуляцией могут быть предоставлены в качестве входных данных для инструмента в случае пользователь заинтересован в конкретных мутациях или родословных.На основе этих входных данных lineagespot идентифицирует потенциальные варианты SARS-CoV-2 во входных образцах и создает метрики для количественной оценки присутствия каждой линии.

    2. II.

      Панголин как источник определений

      Первоначально создается вектор всех позиций генома, для которого каждая позиция устанавливается равной нуклеотидам эталонного генома.Затем считывается каждый файл VCF и формируется набор новых правил путем установки каждой позиции файла с сообщенной мутацией или несколькими мутациями (в случае, если в одной и той же позиции имеется более одной сообщенной мутации). Следует отметить, что позиции, которые были обнаружены с более чем одной мутацией, должны включать их все в столбце ALT VCF в формате с разделителями-запятыми. Большинство различных инструментов вызывающего абонента ( freebayes , GATK и т. д.) делают это по умолчанию. Наконец, из первого вектора удаляются позиции с нулевой глубиной чтения ссылки.Оставшиеся два вектора объединяются в один. В дополнение к нахождению всех позиций, которые необходимо установить равными выделенной базе, добавляются еще четыре правила для каждой позиции генома. Эти правила содержат все основания , а не , равные нуклеотиду исходного правила. Например, если позиция 5388 равна основанию «A» (представляющее правило 5388  =  =  «A» ), то добавляются четыре новых правила, содержащие все основания, не равные «A», например, 5888!  =  «Т», 5388!  =  «Г», 5388!  =  ‘С’, 5388!  =  ‘–’ (где символ ‘–’ обозначает пробел в упомянутой последовательности).Наконец, все правила объединяются в единый вектор, представляющий эту конкретную родословную.

    Второй этап направлен на сравнение мутаций, полученных из файла VCF, с мутациями родословной. В частности, все правила принятия решений считываются из входного файла Pangolin, и для каждой линии соответствующие правила сравниваются с окончательным вектором правил.

    Следует отметить, что наличие панголина в качестве источника определений родословных основывается на следующем предположении.Учитывая группу чтений, удовлетворяющих правилу A происхождения L, и другую группу чтений, удовлетворяющих правилу B, из того же происхождения L, то происхождение L назначается неправильно. В качестве примера предположим, что группа прочтений удовлетворяет только первым двум правилам из происхождения B.1.177.17 (28 931! = ’A’, 25 613! = ’G’), а другая группа прочтений удовлетворяет следующим двум правилам из та же родословная (407!   = ‘–’, 22 087!   =   ‘A’). На основании приведенного выше описания метода происхождение B.1.177.17 будет помечено как идентифицированное происхождение, даже если ни одно из чтений не удовлетворяет всем правилам происхождения.Чтобы снизить этот риск, мы принимаем во внимание ряд различных индикаторов, отражающих общее количество удовлетворенных правил, количество правил, которые удовлетворены на основе обнаруженных мутаций, и общее количество чтений, которые поддерживают как эталонные, так и аллель для каждого из правил. Три метрики вычисляются и сохраняются в выходном файле; общее количество правил, ведущих к связанной родословной, количество правил, которым удовлетворяет созданный вектор правил, рассматривая правила ящера как дерево решений, и общее количество удовлетворенных правил.Кроме того, рассчитываются соответствующие значения отношения, что дает процент удовлетворения каждой линии.

    Источник клонально-специфических мутаций

    Для выявления клоноспецифичных мутаций использовались три различных источника данных; панголин, ВЭО и вспышка.инфо . Пример различий между тремя источниками представлен на дополнительном рисунке 1, на котором сравнивается обнаружение B.1.1.7 с использованием (A) данных outbreak.info, (B) панголина и (C) данных VEO. lineagespot использует вспышку по умолчанию.информационные отчеты.

    Матрица сокращений

    См. Таблицу 7.

    Таблица 7 Таблица сокращений, содержащая все используемые в тексте сокращения.

    Особенности магазина — theinksupply

    Легко создавайте гибкие сетки категорий для ваших продуктов. Управляйте количеством столбцов, автоматическим макетом кладки, цветом, выравниванием текста, интервалами и многим другим!

    Комплект для заправки чернил

    19 товаров

    Термолента для этикеток

    43 товара

    Картридж с тонером

    71 товар

    Salient предлагает два дополнительных настраиваемых макета продукта, чтобы помочь продемонстрировать свои продукты так, как вы считаете наиболее подходящим.

    Миниатюры с выравниванием по нижнему краю

    Аналогичен структуре макета отдельного продукта WooCommerce по умолчанию, но тонко изменен и дополнен сенсорными ползунками. Ползунок эскизов продуктов действует как навигация для ползунка основной галереи, расположенного над ним.

    Этот макет позволяет вашим пользователям свободно прокручивать изображения ваших продуктов, сохраняя при этом информацию о продукте и миниатюры в поле зрения.

    Удобные для сенсорного управления слайдеры-карусели продуктов могут отображаться в выбранном вами столбце, в полную ширину или в виде отдельных элементов. Также позволяет использовать все параметры запроса WooCommerce по умолчанию, т. е. категории продуктов, тип продукта, заказ по и т. д.

    Salient 9.0 теперь предлагает точное управление колонками продуктов на страницах продуктов WooCommerce.Легко выбирайте от 2 до 6 столбцов по отдельности для окон просмотра Desktop, Small Desktop, Tablet и Mobile.

    Представляем возможность быстрого просмотра продуктов Salient. Позвольте вашим пользователям видеть больше информации о продукте и изображений, не покидая своего текущего местоположения. Результатом является более плавный и интуитивно понятный пользовательский интерфейс.

    Совместимые фильтры продуктов YITH Ajax

    Salient поддерживает популярный подключаемый модуль YITH Ajax, связанный с WooCommerce, фильтры продуктов и предоставляет расширенные пользовательские стили для фильтров.

    Ускорьте процесс покупки, исключив дополнительные шаги перед оформлением заказа и повысив удобство для своих пользователей.

    Готовы к следующему шагу?

    Создайте красивый магазин на базе WooCommerce

    Названия и логотипы Brother, Brady, Canon, Casio, Dymo, Epson, Fuji Xerox, Lexmark, HP, Samsung и других производителей являются зарегистрированными товарными знаками соответствующих владельцев.
    Любые обозначения или ссылки на торговые марки сделаны исключительно в целях демонстрации совместимости.

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.